應(yīng)用導(dǎo)入HSVtk基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究

李少一，高蕓，劉宏宇，郭文昌，王國棟，李曉東，馬維寧，劉云會

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004；2.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，沈陽 110001）

盡管現(xiàn)代診斷技術(shù)和治療方法有了很大的提高，作為最常見、惡性程度最高的原發(fā)腦腫瘤——膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其預(yù)后仍非常差。從診斷之日起計(jì)算，患者的中位生存期大致為1年，并且近30多年來沒有明顯改善［1］。盡管應(yīng)用HSVtk基因和更昔洛韋（ganciclovir，GCV）的自殺基因療法已經(jīng)得到臨床證實(shí)［2］，但是結(jié)果并不令人滿意。部分是因?yàn)橛衫w維母細(xì)胞衍生而來的載體細(xì)胞的遷移活動具有局限性，使其不能廣泛覆蓋已經(jīng)浸潤到周圍腦組織的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。為了增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的遷移活動，許多研究報(bào)道［3～5］了以神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）作為載體，兩種細(xì)胞對包括膠質(zhì)瘤及各種腦損傷都表現(xiàn)出較強(qiáng)的趨向性。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，在BMSCtk和C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間存在極強(qiáng)的旁觀者效應(yīng)［6］。這些研究資料表明，作為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤一項(xiàng)新的方法，“BMSCtk療法”是很有前景的。

HSVtk陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞之間的旁觀者效應(yīng)已經(jīng)得到深入的研究，尤其是在細(xì)胞間通訊方面。同時(shí)，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，BMCStk與C6細(xì)胞之間的旁觀者效應(yīng)也是非常強(qiáng)的［6］。本研究我們觀察在體外條件下，人BMSCtk細(xì)胞與人和大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間的旁觀者效應(yīng)，并觀察各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對BMSCtk的趨化作用。

1 材料和方法

1.1 人BMSCtk細(xì)胞的制備

人BMSC細(xì)胞和人BMSC細(xì)胞培養(yǎng)液購自康伯司生物科學(xué)公司。復(fù)制缺陷型HSVtk逆轉(zhuǎn)錄病毒的PA317包裝細(xì)胞由Genetic Therapy公司提供。將PA317細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，取上清液儲藏于-80℃的環(huán)境中備用。在25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，以5×103/cm2的密度接種BMSC細(xì)胞，培養(yǎng)24 h之后，在3 mL的新鮮培養(yǎng)液和1 mL的HSVtk逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液（含有8 μg/mL的Polybrene）繼續(xù)培養(yǎng)5 h，然后更換細(xì)胞培養(yǎng)液。應(yīng)用150 μg/mL的G418（Sigma?Aldrich）進(jìn)行1周耐藥性篩選后，收集存活的耐藥性細(xì)胞（BMSCtk細(xì)胞）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 大鼠BMSCtk細(xì)胞的制備

大鼠BMSC細(xì)胞取自6周齡的SD大鼠，用連接23G針頭的5 mL注射器從大鼠的股骨和脛骨抽吸骨髓，懸浮于鼠BMSC培養(yǎng)液（Stem Cell Technolo?gies Inc.Mesencult?）中。所有骨髓細(xì)胞通過70 μm的尼龍細(xì)胞過濾器濾過，并以5×103/cm2的密度播種于10 cm的培養(yǎng)盤中。24 h后更換培養(yǎng)液，此后2～3 d更換1次。除了使用鼠BMSC培養(yǎng)液以外，HSVtk基因的轉(zhuǎn)移和藥物耐藥性選擇的方法與前述人BM?SC的方法相同。制備成功的大鼠BMSCtk細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 BMSCtk細(xì)胞和各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株之間的旁觀者效應(yīng)檢測

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（A?172、YKG?1、T98G）、人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（Daoy、TE671）和大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（C6、9L）購自ATCC公司。分別將上述7種膠質(zhì)瘤細(xì)胞與相同數(shù)量的人或大鼠BMSCtk細(xì)胞共培養(yǎng)于含有或不含有1 μg/mL的GCV的培養(yǎng)液中，播種于96孔培養(yǎng)板上。對照組為5×103腫瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)于含有或不含有GCV的培養(yǎng)液中。條件培養(yǎng)液每2天更換1次，并在第7天用MTT分析法檢測存活的細(xì)胞數(shù)量。以測定結(jié)果相對于培養(yǎng)在不含有GCV的培養(yǎng)液中的腫瘤細(xì)胞的吸光百分比作為評價(jià)其抗腫瘤活性的指標(biāo)。

1.4 體外遷移實(shí)驗(yàn)

我們用24孔Matrigel小室（BD Biosciences）來評價(jià)BMSC的趨化遷移能力。人BMSC細(xì)胞用條件培養(yǎng)液（不含10%FBS，含1%BSA）重懸細(xì)胞后制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，按每室0.5 mL接種于Matrigel侵襲室的上層，每組3個(gè)復(fù)孔。下室放入0.75 mL不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，取出上層的小室，去除基質(zhì)膜上未侵襲轉(zhuǎn)移細(xì)胞，以Diff?Quik試劑盒染色穿膜細(xì)胞后在200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外實(shí)驗(yàn)中人BMSCtk細(xì)胞和各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株之間的旁觀者效應(yīng)

無論是人還是大鼠的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，當(dāng)與人BM?SCtk細(xì)胞共同培養(yǎng)，并在GCV（1 μg/mL）存在時(shí)，其細(xì)胞增殖活性較沒有GCV時(shí)顯著受到抑制（圖1，P＆lt;0.01）。這表明，人BMSCtk細(xì)胞與不同種屬和類別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間存在一種明顯的旁觀者效應(yīng)。而當(dāng)沒有GCV存在時(shí)，人BMSCtk對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖沒有明顯的抑制效應(yīng)。

圖1 人BMSCtk細(xì)胞和不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間的旁觀者效應(yīng)Fig.1 Bystander effect between human BMSCtk and various glioma cells

2.2 體外實(shí)驗(yàn)中大鼠BMSCtk細(xì)胞和各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株之間的旁觀者效應(yīng)

在大鼠BMSCtk細(xì)胞與各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間也觀察到明顯的旁觀者效應(yīng)（圖2）。結(jié)果表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，由大鼠BMSCtk細(xì)胞和GCV所引發(fā)的旁觀者效應(yīng)不具有膠質(zhì)瘤細(xì)胞類型和種屬特異性。

圖2 大鼠BMSCtk細(xì)胞和不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間的旁觀者效應(yīng)Fig.2 Bystander effect of rat BMSCtk on various type of glioma cells

2.3 體外實(shí)驗(yàn)中膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基對人BMSCtk細(xì)胞的趨化作用

人BMSCtk細(xì)胞的遷移能力通過體外遷移實(shí)驗(yàn)來評估。當(dāng)Matrigel小室下室由條件培養(yǎng)基（即各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)液）填充時(shí)，人BMSCtk細(xì)胞能活躍地通過人工基膜基底層和微孔，而當(dāng)Matrigel小室下室由新鮮DMEM培養(yǎng)基填充時(shí)，則人BMSCtk細(xì)胞很少有遷移活動（圖3）。

圖3 人BMSCtk細(xì)胞體外遷移能力Fig.3 In vitro migratory capacity of human BMSCtk cells

3 討論

在HSVtk/GCV自殺基因療法中，“旁觀者效應(yīng)”介導(dǎo)的抗腫瘤活性已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注和證實(shí)。而在這個(gè)系統(tǒng)中，如何選擇一個(gè)合適的載體將tk基因攜帶到腫瘤細(xì)胞周圍成為一個(gè)關(guān)鍵問題。在以往的實(shí)驗(yàn)中，我們使用從SD大鼠胚胎腦中分離并培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞作為tk表達(dá)細(xì)胞，探討了它們在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用。將C6細(xì)胞與不同數(shù)量的tk神經(jīng)干細(xì)胞混合后培養(yǎng)在含有1 μg/mL GCV的DMEM培養(yǎng)液中，觀察到了極強(qiáng)的抗腫瘤活性［5］。為了將來在臨床中有效地應(yīng)用這一治療方案，本研究選用了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞這一可能從患者自身提取的細(xì)胞作為載體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在更昔洛韋的存在下，人類BMSCtk細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有很顯著的體外抗腫瘤活性。與新鮮培養(yǎng)基比較，從人類和大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基都可以增強(qiáng)人BMSC向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移活性。

在目前的研究中，我們使用和腫瘤細(xì)胞等量的BMSCtk細(xì)胞（BMSCtk細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞=1∶1）。我們之前以不同比例混合C6細(xì)胞和BMSCtk細(xì)胞（從1∶1到1∶128混合BMSCtk細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞）或轉(zhuǎn)導(dǎo)了神經(jīng)干細(xì)胞的HSVtk細(xì)胞來檢測旁觀者效應(yīng)的強(qiáng)度，該研究表明BMSCtk細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞的比例為1∶16時(shí)能產(chǎn)生非常強(qiáng)效的旁觀者效應(yīng)［6］。將來的研究中，我們應(yīng)當(dāng)對不同的BMSCtk細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞組合進(jìn)行一項(xiàng)針對其組成比例的劑量反應(yīng)研究。由于這項(xiàng)研究的目的在于檢測細(xì)胞類型和種屬特異性，所以當(dāng)前我們只進(jìn)行了共植實(shí)驗(yàn)研究。很顯然，同之前的治療研究一樣，我們需要在進(jìn)一步的研究中檢測已構(gòu)建的顱內(nèi)腫瘤模型中的這種旁觀者效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)中，我們?nèi)匀徊捎玫氖巧逃萌祟怋MSC細(xì)胞來作為運(yùn)載細(xì)胞。這樣一來，目前的研究就存在一種局限性：商用人類BMSC細(xì)胞并不能代表從患者身上獲得的普通BMSC細(xì)胞。它們可能不會像干細(xì)胞那樣表現(xiàn)出多重分化能力，顯然，我們需要做更多的研究，以構(gòu)建出理想的載體細(xì)胞，供臨床使用。研究表明，構(gòu)建并廣泛應(yīng)用于神經(jīng)重組科學(xué)領(lǐng)域的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞也能成為基因療法中合適的載體細(xì)胞［7］。研究證實(shí)，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞在腦腫瘤條件培養(yǎng)液中存在強(qiáng)效的遷移活動，而這種活動也不具有腫瘤細(xì)胞類型特異性或種屬特異性［8，9］。

為了方便臨床應(yīng)用，如果預(yù)先制備的同種異體或異種載體細(xì)胞能得到使用，那么可以在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的起始治療階段使用上述載體細(xì)胞，這將使得這種治療方法更為可行。本研究表明，由人BMSCtk細(xì)胞和GCV引發(fā)的旁觀者效應(yīng)能對抗多種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，也能對抗鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞。假如由免疫學(xué)反應(yīng)引起的安全問題得到妥善解決的話，提前制備的BMSCtk細(xì)胞株能運(yùn)用于以BMSC細(xì)胞為基礎(chǔ)的HS?Vtk/GCV基因治療中，而“BMSCtk療法”將會成為更簡單、可行的治療惡性膠質(zhì)瘤的一種新的治療手段。

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