天花粉蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

謝博超

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科 湖南 衡陽(yáng) 421001）

天花粉蛋白（Triehosanthin，TCS）是從葫蘆科植物栝樓（一chosanthin kirilouii Maxim）的塊根中提取出來(lái)的一種單鏈核糖體失活蛋白（ribosome－indctivating protein，RIP），具有多種生物學(xué)效應(yīng)，主要包括免疫凋節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等作用。目前，TCS的抗腫瘤研究主要集中在絨毛膜上皮癌、胃腸道腫瘤和白血病等方面。本實(shí)驗(yàn)研究TCS 對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的角度探討其抗癌作用，探討TCS抗宮頸癌作用及其機(jī)制。

1 準(zhǔn)備材料及實(shí)驗(yàn)方法

1．1 藥品及試劑：TCS購(gòu)自上海金山制藥有限公司（1．2g／L），培養(yǎng)基DMEM（GBICO 公司），新生牛血清FBS（四季青），碘化丙啶（PI）及RNA 酶（Simga公司產(chǎn)品），組織基因組DNA 提取試劑盒及DNA Ladder（北京天根生化科技有限公司），DNA 甲基化試劑盒（北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司），Taq DNA 聚合酶及dNTPMix（Amresco公司）。電泳儀（－C Apparatus Corpora．tion產(chǎn)品），微型凝膠電泳系統(tǒng)（Bio－Rad產(chǎn)品），DY－Ⅲ電泳槽（北京六一儀器廠產(chǎn)品），凝膠成像系統(tǒng)分析儀（上海天能科技有限公司產(chǎn)品）。

1．2 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)：HeLa（人宮頸癌）細(xì)胞（為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株）。將細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2的濕化細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中。培養(yǎng)基DMEM 含10%FBS，0．1U／L青霉素，0．1U／L鏈霉素，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞待用。

1．3 HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)采用噻唑藍(lán)（MTT）還原法進(jìn)行：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，用96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行接種（每孔的培養(yǎng)基細(xì)胞數(shù)為4000個(gè)），待培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組換新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基加不同濃度TCS，使終濃度分別為10、20、40、80、160mg／L，置入CO：加入MTT，培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24，48，72h后，將上清去除每孔加入150DMSO，然后將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上輕度振蕩10min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm 處光吸收值（OD 值）。取8孔吸收值平均數(shù)，按公式細(xì)胞抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值／對(duì)照組平均吸光度值）×100% 計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

1．4 細(xì)胞周期觀察及凋亡檢測(cè)

1．4．1 DNA 瓊脂糖凝膠電泳胰蛋白酶消化收獲實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照細(xì)胞：l000r／min離心5min，PBS清洗細(xì)胞兩遍，NP－40 溶液作用細(xì)胞沉淀，加入SDS（終濃度l%）及RNase，56℃處理2h，蛋白酶K37℃作用3－5h，加入1／10體積的3M 醋酸鈉及2倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕振搖后置于一70℃冰箱中過(guò)夜，14 000r／min離心15min，將上清去除，用冰冷的70%乙醇漂洗，1．2% 瓊脂糖凝膠電泳3－5h，紫外燈下觀察并成像。

1．4．2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分別離心收集對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞：以含0．2%FBS的PBS清洗后加入75%冰冷的乙醇固定，在10000r／min條件下離心5min，去乙醇，PBS洗滌兩次，將上清去除；加入等體積的細(xì)胞裂解緩沖液室溫作用下5min，加Rnase A 置37℃水浴中消化30min，離心后再加人1ml PI染色避光染色30min。

1．4．3 取不同濃度TCS（20、40和80 mg／L）分別作用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，采用Modfit分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期DNA 含量分析及細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，細(xì)胞周期與凋亡率組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD和SNK 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 MTT 法測(cè)定TCS對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，見(jiàn)表1。

20，40和80mg／l的天花粉蛋白分別作用于Hela細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，且抑制率隨藥物濃度增加而上升，呈一定的劑量、時(shí)效依賴性。見(jiàn)表1。

2．2 TCS對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率的影響：分析TCS作用HeLa細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率的變化，三種TCS濃度作用后分別與對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0．01）。三種濃度之間比較亦有顯著差異（P＜0．01）。由分析數(shù)據(jù)可得，隨著天花粉蛋白藥物濃度的增大及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞的比例增加，表明TCS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡具有時(shí)間和劑量依賴性。（見(jiàn)表2）

表1 TCS（不同濃度）對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率

表2 凋亡細(xì)胞在各組中的百分比變化及TCS（不同濃度）對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率的影響

2．3 TCS對(duì)HeLa細(xì)胞DNA 斷裂的影響：經(jīng)凝膠電泳分析出TCS（不同濃度）對(duì)HeLa細(xì)胞DNA 的影響，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)斷裂的狀況，呈現(xiàn)出HeLa細(xì)胞凋亡的梯級(jí)格局。見(jiàn)圖1；對(duì)照組的細(xì)胞DNA 無(wú)斷裂現(xiàn)象出現(xiàn)（見(jiàn)圖2）。

3 討論

經(jīng)本文研究發(fā)現(xiàn)，TCS對(duì)HeLa細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，呈量效關(guān)系。天花粉蛋白是從中草藥天花粉（栝樓塊根）中分離得到的一種Ⅰ型核糖體失活蛋白質(zhì)，TCS為247個(gè)氨基酸殘基組成的單一多肽鏈，TCS屬于RNAN 一糖苷酶型，專一水解核糖體28SrRNA 第4324位腺苷酸的NC糖苷鍵，從而引起核糖體某些區(qū)域構(gòu)象的改變，影響核糖體的生物學(xué)功能，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。隨著天花粉蛋白的深入研究和應(yīng)用范圍的拓展，其藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值13益引起廣泛關(guān)注?？蒲腥藛T對(duì)鮮藥材植物栝樓的種植，藥物的采集、提取、分離純化以及進(jìn)一步加工和分子克隆等，都進(jìn)行了相關(guān)研究。當(dāng)前，作為商品化的天花粉蛋白已在臨床使用。商品天花粉蛋白主要從鮮植物體中提取，部分利用分子克隆技術(shù)體外表達(dá)，但在這些過(guò)程中蛋白活力會(huì)受到不同程度的影響，其藥物效力也將隨之改變。

細(xì)胞增殖失控和凋亡受阻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要原因，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的重要手段之一。TCS能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，且TCS濃度與凋亡率之間存在量效關(guān)系。有研究表明，天花粉蛋白具有核酸內(nèi)切酶功能，能夠切割細(xì)胞DNA 超螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。另外，TCS可能通過(guò)與受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的激活或抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的一種極其復(fù)雜的生理變化過(guò)程，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的紊亂調(diào)節(jié)性密切相關(guān)。有很多資料發(fā)現(xiàn)，很多的抗癌藥物都是通過(guò)最終觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡從而達(dá)到治療的目的，所以有效的誘其腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的新方法之一。天花粉蛋白是一種新型的有效的專一的抗腫瘤藥物，與一般的化療藥物不同，一般的化療藥物會(huì)造成腫瘤和正常細(xì)胞全部凋亡，TCS對(duì)人的外周血淋巴細(xì)胞、T 細(xì)胞等正常細(xì)胞影響很小，所以相對(duì)于一般的化療藥物有非常顯著的優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)將天花粉蛋白處理人宮頸癌HeLa細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制。出現(xiàn)凋亡的特征性改變，凝膠電泳呈現(xiàn)典型的梯級(jí)格局，而且凋亡細(xì)胞的比例隨藥物濃度的增高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。這些結(jié)果表明天花粉蛋白能抑制HeLa細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。有關(guān)天花粉蛋白誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚在進(jìn)一步研究之中，天花粉蛋白有良好的應(yīng)用前景，廣大醫(yī)學(xué)研究者共同努力，將其早日應(yīng)用于臨床抗宮頸癌的治療，為宮頸癌患者的康復(fù)帶來(lái)新的福音。

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