衰老過程中線粒體順烏頭酸酶活性變化對(duì)能量合成的影響*

葉 薇， 陳賽慧， 郝東杰， 鄭 屹， 曹建明， 呂建新△

(溫州醫(yī)學(xué)院 1檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，2環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江溫州325035)

線粒體不僅是真核細(xì)胞能量合成和活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的主要場所，線粒體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)更易成為ROS作用的位點(diǎn)。ROS累積影響電子傳遞鏈復(fù)合體的活性，進(jìn)而造成線粒體損傷［1-3］。目前研究發(fā)現(xiàn)，在衰老相關(guān)的疾病中，細(xì)胞ROS生成過多可引起線粒體能量代謝障礙，從而導(dǎo)致一些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生或惡化。

線粒體中含有大量的鐵硫蛋白，其中的鐵硫簇被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)ROS敏感的作用位點(diǎn)之一。線粒體順烏頭酸酶(mitochondrial aconitase，ACO2)是催化三羧酸循環(huán)的酶，催化檸檬酸經(jīng)過順烏頭酸最終轉(zhuǎn)化為異檸檬酸，是活細(xì)胞中心代謝途徑中不可缺少的酶。ACO2是衰老過程中氧化損傷的主要靶標(biāo)之一［4-5］。該酶是一個(gè)四結(jié)構(gòu)域鐵硫蛋白，在第3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的鐵硫簇(［4Fe-4S］2+)是酶促反應(yīng)的催化中心，［4Fe-4S］2+容易受到ROS的氧化作用失去Fe2+而形成［3Fe-4S］+，從而導(dǎo)致該酶失活［6-7］。鐵硫簇的破壞不僅使酶失活，影響三羧酸循環(huán)，其釋放的游離鐵可能會(huì)進(jìn)一步通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生有害的氧自由基，加重細(xì)胞的氧化壓力，引起線粒體中DNA及更多蛋白的氧化損傷。為進(jìn)一步驗(yàn)證ACO2活性在衰老過程中是否由于ROS累積而下降，及其潛在的對(duì)于能量合成的影響，我們以SD大鼠和D-半乳糖(D-galactose，DGal)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老為模型，觀察自然衰老大鼠和細(xì)胞衰老模型的ACO2在活性及表達(dá)水平的變化，并分析線粒體膜電位及能量合成的水平，以了解在衰老過程中該酶的變化對(duì)于能量合成的影響。

材料和方法

1 動(dòng)物和細(xì)胞

選用月齡為1月、8月、16月和24月SD雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，合格證編號(hào)為 SCXK(浙)2010-0044，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)符合國家清潔級(jí)環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，每籠不超過5只，自由飲食，在自然條件下衰老。細(xì)胞選用MRC-5人胚肺成纖維細(xì)胞。

2 主要試劑

過氧化氫酶(catalase)、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADP)、順烏頭酸(cis-aconitic acid)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate)、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase)、ATP、ADP和 AMP(HPLC 級(jí)別)均購自Sigma;BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)和細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ亞基(cytochrome C oxidease subunitⅣ，COXⅣ)抗體均購自碧云天生物技術(shù)研究所;線粒體順烏頭酸酶Ⅰ抗購自Abcam;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司;Trizol和DEPC水購自Invitrogen。所用引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液(100×)的高糖(25 mmol/L)DMEM培養(yǎng)液接種MRC-5人胚肺成纖維細(xì)胞，37℃、95%空氣、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖并長滿培養(yǎng)瓶表面后，胰蛋白酶37℃消化1 min左右，輕輕吹打使團(tuán)狀細(xì)胞分散，以需要的密度傳代細(xì)胞。D-Gal處理細(xì)胞:24 h細(xì)胞帖壁后，換用含55 mmol/L D-Gal的DMEM培養(yǎng)72 h。

3.2 線粒體的分離 線粒體提取方法參照文獻(xiàn)［8］的蔗糖密度梯度離心法，并對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)。

3.3 ACO2活性的檢測 以檸檬酸鈉為底物，偶聯(lián)NADP+-異檸檬酸脫氫酶反應(yīng)，通過340 nm處吸光度測定該反應(yīng)過程中NADPH生成的量間接表示順烏頭酸酶活性的大小。酶活性定義為:每毫克蛋白每分鐘所增加的吸光度。具體方法如下:取大鼠腦組織線粒體，裂解得線粒體蛋白，100μg線粒體沉淀加線粒體裂解液。充分混勻，冰上裂解30 min，15 000×g、4℃ 離心5 min。96孔板每孔加200μL酶反應(yīng)底物，再加入離心后上清10μL，混勻，用酶標(biāo)儀檢測340 nm處吸光度。溫度設(shè)定為37℃，每分鐘測1次，共測20 min。蛋白濃度用碧云天BCA蛋白檢測試劑盒檢測。

體外氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn):(1)不同濃度 H2O2對(duì)酶活性的影響:1月齡大鼠所提取線粒體，用H Buffer懸浮后均等分到5個(gè)離心管中，12 000×g、4℃離心5 min，沉淀分別加 0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200μmol/L和400μmol/L H2O2200μL，充分混勻，冰上孵育30 min;(2)不同時(shí)間H2O2處理對(duì)酶活性的影響:1月齡大鼠所提取線粒體，用H Buffer懸浮后均等分到4個(gè)離心管中，12 000×g、4℃離心5 min，所得沉淀加50μmol/L的 H2O2200μL，充分混勻，分別處理0 min、30 min、1 h和2 h。經(jīng)上述處理后，14 000 ×g、4 ℃離心 5 min。去除上清 H2O2，再加裂解液，離心取上清，測酶活性，方法同上。

3.4 ACO2蛋白表達(dá)量測定 分離線粒體，裂解后得到線粒體蛋白。用BCA法檢測蛋白濃度，按1∶4體積比加loading buffer，95℃加熱5 min使蛋白變性。制備12%分離膠，蛋白上樣量為60μg，marker上樣量為5μL。70 V電壓，電泳30 min，然后用120 V，電泳1 h。轉(zhuǎn)膜1.5 h，剪取蛋白條帶，用5%脫脂奶粉TBST室溫封閉2 h。4℃ Ⅰ抗孵育過夜，用TBST洗膜5 min，重復(fù)4次，室溫孵育Ⅱ抗1 h，用TBST洗膜10 min，重復(fù)4次。以線粒體蛋白COXⅣ為內(nèi)參照。

3.5 熒光定量PCR檢測ACO2 mRNA表達(dá)水平采用Trizol抽提法提取腦組織和細(xì)胞總RNA，RNA濃度測定使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo)。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ACO2 mRNA水平，以β-actin為內(nèi)參照。按照TaKaRa說明書配制反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為:95℃變性30 s，95℃ 15 s，50℃10 s，72 ℃ 20 s，45 個(gè)循環(huán)。

3.6 大鼠腦組織總鐵含量的測定 取大鼠大腦組織，加入5 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，1 mg組織加1 mL。用勻漿器充分勻漿，超聲破碎，所得勻漿液加入等體積1.5 mmol/L HCl，85℃加熱30 min;2 000×g室溫離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，加1/5體積的40%三氯乙酸，85℃加熱15 min，12 000×g離心10 min取上清，加入10倍體積1.0 mmol/L菲咯嗪試劑(1.0 mol/L醋酸鈉配制)充分反應(yīng)，取220 μL上一步混合液于96孔板中，562 nm測吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鐵含量。

3.7 細(xì)胞氧化還原狀態(tài)分析 細(xì)胞SOD活性和MDA含量根據(jù)試劑盒(南京建成)提供的方法進(jìn)行檢測。細(xì)胞ROS水平檢測:MRC-5細(xì)胞按2.5×108/L接種至6孔板，24 h細(xì)胞貼壁后將其分為對(duì)照組和D-gal處理組，分別按處理?xiàng)l件培養(yǎng)細(xì)胞72 h。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA，6孔板的每個(gè)孔不少于1 mL。置37℃孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長檢測DCF的熒光。

3.8 JC-1檢測線粒體膜電位 分離大鼠腦組織線粒體，用1 mL PBS溶解提純的線粒體，取其中200 μL移入到1.5 mL的離心管內(nèi)，加PBS至1.5 mL混勻后離心;取沉淀加入1.25 mL staining mixture，避光，37℃孵育3 min。去除 staining mixture，用1×staining solution洗滌液洗3次，用1 mL PBS重懸。準(zhǔn)備酶標(biāo)條，每孔加200μL上一步的懸液，平行設(shè)置5個(gè)孔。利用Varioskan Flash酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)測定590 nm和530 nm的熒光強(qiáng)度，兩者比值反映線粒體膜電位。

MRC-5細(xì)胞按2.5×108/L接種至6孔板，24 h細(xì)胞貼壁后將其分為對(duì)照組和衰老組(D-Gal處理組)。培養(yǎng)72 h后按6孔板每孔1 mL的量加入JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻;細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育30 min。用1×JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞2～3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察并成像。

3.9 高效液相色譜檢測ATP、ADP和AMP含量高效液相系統(tǒng)包括Agilent 1100高效液相色譜儀和C18反相高效色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm，pH 2～8)。流動(dòng)相為15 mmol/L磷酸二氫鉀和10%甲醇，流速0.8 mL/min，檢測波長為254 nm，檢測溫度為25℃。所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在進(jìn)樣前均用0.22μm孔徑濾器過濾，以防堵塞儀器管道。(1)標(biāo)準(zhǔn)品配制:稱取ATP、ADP和AMP標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，用10 mL pH 9.0的磷酸鹽緩沖液溶解于15 mL離心管，避光保存。用時(shí)取50μL標(biāo)準(zhǔn)品液，加超純水950μL(稀釋20 倍)，再依次稀釋成2、4、8、10、15 和 20 倍來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)樣品前處理:用在液氮罐中預(yù)冷的刀片切取大鼠腦組織大腦皮層約100 mg并稱重，按每100 mg樣品量加入1 000μL高氯酸溶液 (0.3 mmol/L)，在冰上充分勻漿，取全部勻漿液于4℃、10 000 r/min離心10 min，取出上清液400μL，加0.5 mmol/L氫氧化鉀200μL(終溶液 pH 7.6～7.8)，于4℃、10 000 r/min離心5 min，取上清。(3)結(jié)果計(jì)算:以保留時(shí)間定性，色譜峰面積定量。ATP、ADP和AMP的計(jì)算公式為:X=C×K［X:ATP、ADP和m AMP的含量(mg/g組織凈重);C:從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的ATP、ADP和 AMP的量(μg);m:樣品的質(zhì)量(mg);K:樣品組織勻漿稀釋倍數(shù)］。能荷(energy charge，EC)計(jì)算公式為:)/(ATP+ADP+AMP)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖，計(jì)量資料采用One-way ANOVA或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ACO2活性和表達(dá)水平

1.1 自然衰老大鼠和衰老細(xì)胞ACO2活性的變化圖1A顯示隨著大鼠月齡的增長，ACO2表現(xiàn)出很明顯活性遞減(P＜0.01)。與1月齡相比，8月齡的酶活性下降了13.8%，16月齡下降了42%，24月齡的老齡鼠則下降了84.8%。而在衰老細(xì)胞中ACO2活性較對(duì)照組細(xì)胞降低(P＜0.01)，見圖1B。

1.2 體外氧化應(yīng)激下ACO2活性分析 以純水處理為空白對(duì)照，H2O2處理后ACO2活性隨H2O2濃度增加而降低(P＜0.01)，見圖1C。用高濃度(400 μmol/L)H2O2處理時(shí)，酶活性下降尤為顯著，酶活性下降了93.5%，若再提高H2O2的濃度，則導(dǎo)致酶完全失活。用50μmol/L H2O2處理所提取的線粒體，隨著處理時(shí)間的延長，酶活性逐漸下降(P＜0.01)，見圖1D。這些結(jié)果提示ACO2對(duì)氧化應(yīng)激(H2O2)具有敏感性。

Figure 1.The results of ACO2 activity assay.A:ACO2 activity presented age-related decline;B:ACO2 activity in control and D-Galtreated cells;C:ACO2 activity presented dose-related decline with different H2 O2 concentrations;D:ACO2 activity present time-related decline with different H2O2 incubation time.Mean±SD.n=8.＊＊P ＜0.01 vs 1 month;○○P ＜0.01 vs control;▲▲P＜0.01 vs 0 μmol/L;△△P ＜0.01 vs 0 h.圖1 ACO2活性檢測結(jié)果

1.3 ACO2 mRNA和蛋白表達(dá)水平分析 熒光定量PCR和Western blotting的結(jié)果(圖2A、B)均顯示各月齡的大鼠ACO2 mRNA和蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差別(P＞0.05);在細(xì)胞衰老模型中，在正常和衰老細(xì)胞ACO2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均無明顯差異，見圖2C、D。

Figure 2.The mRNA(A，C)and protein(B，D)expression levels of ACO2 detected by fluorescence quantitative PCR and Western blotting，respectively.A，B:ACO2 expression in brain tissues from the rats at different ages;C，D:ACO2 expression in control and D-Gal-treated MRC-5 cells.Cytochrome C oxidase subunitⅣ(COXⅣ)served as mitochondrial loading control.Mean±SD.n=8.圖2 ACO2表達(dá)水平的比較

2 大鼠腦組織非血紅素鐵含量測定

大鼠腦組織非血紅素鐵含量隨著年齡增長逐漸增加。與1月齡大鼠相比，8月齡、16月齡和24月齡的大鼠腦非血紅素鐵的含量分別增加了14.7%、22.4%和38.5%，見圖3。

Figure 3. Free iron content of whole rat brain at different months.Mean±SD.n=8.＊＊P ＜0.01 vs 1 month.圖3 不同月齡大鼠全腦鐵含量的比較

3 衰老細(xì)胞氧化還原狀態(tài)分析

D-Gal誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞SOD活性降低，且MDA含量顯著增加(P＜0.01)，見表2。

表2 D-Gal誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞SOD活性及MDA含量的比較Table 2.Assessment of SODactivity and MDA content in D-Galtreated cells(Mean±SD.n=8)

4 線粒體膜電位檢測結(jié)果比較

比較老齡鼠(21～25月齡大鼠)與2月齡大鼠的線粒體膜電位，結(jié)果顯示老齡鼠的線粒體膜電位明顯下降(P＜0.05)，見圖4A。在細(xì)胞模型中，對(duì)照組細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度高于D-Gal誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞，而衰老細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組細(xì)胞，提示衰老細(xì)胞線粒體膜電位下降，見圖4B。

Figure 4.Mitochondrial membrane potential in brain tissues from the rats at different ages(A)and in D-Gal-treated MRC-5 cells(B).Mitochondrial membrane potential was measured by JC-1 staining under laser scanning confocal microscope(×200).JC-1 monomer is green fluorescence(530 nm)，and J-aggregate is red fluorescence(590 nm).Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs 2 months.圖4 線粒體膜電位的比較

5 HPLC檢測大鼠腦組織ATP、ADP和 AMP含量及其能荷比較

對(duì)各月齡大鼠腦組織的ATP、ADP和AMP含量進(jìn)行高效液相色譜分析。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為，ATP:y=1．7428x+0．967(R2=0．9996);ADP:y=1．3151x+7．2975(R2=0．9995);AMP:y=2.6214x+13．820(R2=0.9991)。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得3種腺苷酸在腦組織中的含量見表3。ATP隨月齡增加而下降，1月齡和8月齡大鼠腦組織ATP比較下降不明顯(P＞0.05)，24月齡大鼠與1月齡相比，其含量降低了約42%。ADP隨月齡增加有所升高，其升高幅度沒有AMP大，與1月齡相比，24月齡大鼠的ADP含量約上升了39%，而AMP的含量升高了117%。各月齡的能荷呈逐漸降低的趨勢，差異顯著(P＜0.01)，見圖5A。細(xì)胞衰老模型的結(jié)果顯示衰老細(xì)胞的ATP含量和能荷較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，見表 4、圖 5B，AMP 含量升高(P ＜0.05)，ADP含量無明顯差別。

Figure 5.Energy charge in brain tissues from the rats at different ages(A)and in D-Gal-treated MRC-5 cells(B).Mean±SD.n=8.＊＊P ＜0.01 vs1 month;△△P ＜0.01 vs control.圖5 不同月齡大鼠腦組織和D-Gal誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞能荷的測定

表3 不同月齡大鼠ATP、ADP和AMP含量的比較Table 3.ATP，ADP and AMP content in brain tissues from the rats at different ages(mg/g.Mean±SD.n=8)

表4 D-gal誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞ATP、AMP和AMP含量的比較Table 4.The content of ATP，ADP and AMP in D-Gal-treated MRC-5 cells(μg/g.Mean±SD.n=8)

討 論

線粒體不僅是細(xì)胞能量代謝的中心和機(jī)體產(chǎn)生ROS的主要場所，還是ROS攻擊的目標(biāo)，因此線粒體功能的退化成為細(xì)胞衰老的核心事件。線粒體功能障礙主要表現(xiàn)為ATP合成下降、ROS增加、Ca2+代謝紊亂和細(xì)胞凋亡［9］，其中氧化應(yīng)激是引起線粒體功能損傷的主要原因［10］。ACO2是氧化應(yīng)激敏感的酶，是參與三羧酸循環(huán)所有酶中表現(xiàn)出最明顯的增齡性活性下降的酶［5，12-13］，而其活性下降可能與細(xì)胞內(nèi)氧化水平升高有關(guān)。以往對(duì)小鼠腎臟和骨骼肌的研究中［5，12］，發(fā)現(xiàn)線粒體三羧酸循環(huán)的所有酶中僅α-酮戊二酸脫氫酶和ACO2的活性隨增齡下降，其中ACO2活性下降更為明顯。將家蠅的ACO2和檸檬酸合成酶活性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示隨生長時(shí)間增加ACO2的活性呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，檸檬酸合成酶活性無明顯改變［13］。

本研究結(jié)果顯示，大鼠腦組織ACO2的活性表現(xiàn)出增齡性遞減，與1月齡大鼠相比，8月齡的酶活性下降了13.8%，16月齡下降了42%，24月齡的老齡鼠則下降了84.8%。利用H2O2模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，結(jié)果顯示ACO2活性隨著H2O2處理濃度和時(shí)間的增加而呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，提示ACO2對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的高度敏感。而在對(duì)不同月齡大鼠ACO2的mRNA和蛋白水平分析結(jié)果顯示，各月齡大鼠ACO2表達(dá)水平無明顯差異。通過對(duì)不同月齡大鼠ACO2活性比較和體外氧化應(yīng)激下ACO2活性分析，結(jié)合ACO2的表達(dá)水平變化，可以認(rèn)為無論在體內(nèi)還是體外，氧化應(yīng)激均使ACO2活性下降，其內(nèi)在原因是ROS攻擊ACO2活性中心的［4Fe-4S］2+，使其失去一個(gè)Fe2+而成為［3Fe-4S］+，導(dǎo)致ACO2活性下降，即ACO2活性下降是由于蛋白結(jié)構(gòu)域受影響，而非基因表達(dá)下調(diào)所致。因此在衰老過程中，由于ROS的不斷累積導(dǎo)致ACO2活性逐漸下降，而表達(dá)水平不變。

線粒體在含鐵蛋白的生物合成和鐵平衡中起著重要的作用。以往研究發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)鐵累積現(xiàn)象。本研究對(duì)不同月齡大鼠腦組織的非血紅素鐵含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)衰老大鼠的腦鐵含量高于年輕大鼠，這表明衰老過程中伴隨著鐵的積累。盡管目前衰老與細(xì)胞鐵代謝的相關(guān)性尚不明確，且ACO2僅為眾多鐵硫蛋白之一，而在衰老細(xì)胞中ACO2被過多的ROS攻擊后釋放出的Fe2+可能也是導(dǎo)致細(xì)胞鐵增加的原因之一。而過多的游離Fe2+通過Feton反應(yīng)產(chǎn)生更多的超氧陰離子，加重細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

本研究用高效液相色譜法檢測不同月齡大鼠腦組織ATP、ADP和AMP的結(jié)果顯示，能荷隨月齡增加而減小。對(duì)膜電位的研究結(jié)果顯示，衰老大鼠線粒體膜電位下降。線粒體的主要功能體現(xiàn)在線粒體能量合成方面。在三羧酸循環(huán)中，ACO2催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?，而ACO2活性下降可能導(dǎo)致三羧酸循環(huán)的效率下降，同時(shí)引起還原當(dāng)量(NADH)減少，線粒體膜電位下降。線粒體膜電位對(duì)電子傳遞鏈的順利進(jìn)行是至關(guān)重要的，線粒體膜電位下降反映了線粒體膜兩端的電勢差和氧化磷酸化效率的降低，最終造成線粒體的能量合成下降。

此外我們利用D-Gal誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，發(fā)現(xiàn)在衰老細(xì)胞中ACO2活性、膜電位和能量合成水平明顯下降，一方面是由于D-Gal代替葡萄糖后，細(xì)胞獲取能量的主要途徑從糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄緩剑?4］，然而高濃度的D-Gal導(dǎo)致電子傳遞鏈過量產(chǎn)生ROS，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和呼吸功能受損，影響了ATP的合成效率，加重細(xì)胞氧化壓力，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老。另一方面，過量的ROS攻擊ACO2致其失活，引起三羧酸循環(huán)效率下降進(jìn)而影響ATP的產(chǎn)率。所以，在細(xì)胞衰老過程中，隨著ROS不斷產(chǎn)生積累以及清除的減少，在對(duì)細(xì)胞線粒體功能產(chǎn)生影響的同時(shí)，更會(huì)加速衰老的進(jìn)程。該細(xì)胞模型同時(shí)也驗(yàn)證了以上對(duì)于自然衰老過程中ACO2活性變化及其對(duì)能量合成影響的推測。