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    神經(jīng)元核心抗原和神經(jīng)元特異性烯醇化酶在人胚胎小腸發(fā)育階段的表達(dá)*

    2013-12-01 02:29:02劉學(xué)紅
    中國(guó)病理生理雜志 2013年8期
    關(guān)鍵詞:肌間胎齡陽(yáng)性細(xì)胞

    劉學(xué)紅, 張 泳

    (紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江 紹興312000)

    神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)是一種可溶性核蛋白,表達(dá)于脊椎動(dòng)物中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)大多數(shù)發(fā)育成熟的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi),參與細(xì)胞的發(fā)育和損傷修復(fù),其陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量和強(qiáng)度反映了該區(qū)域神經(jīng)元發(fā)育的成熟程度[1-4]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)廣泛存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞胞漿內(nèi),對(duì)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)功能,臨床上常把NSE作為檢測(cè)神經(jīng)元損傷敏感性和特異性的生化標(biāo)志物[5-7]。目前關(guān)于NeuN和NSE在神經(jīng)系統(tǒng)病變方面的研究報(bào)道較多[8-9],但關(guān)于NeuN和NSE在人胚胎小腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化、發(fā)育及演變規(guī)律方面的研究,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道甚少。本文通過(guò)研究人胚胎小腸壁內(nèi)NeuN和NSE的表達(dá)、分布規(guī)律,探討兩者在小腸生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用,旨在為先天性小腸疾病的研究提供形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

    材料和方法

    1 材料收集與分組

    收集因意外原因造成人工流產(chǎn)、發(fā)育正常、受精齡為7~16周的人胚胎標(biāo)本16例,每例標(biāo)本均經(jīng)孕婦本人同意和學(xué)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。以每4周為1月齡組,孕4~8周為第2月胎齡組,孕9~12周為第3月胎齡組,孕13~16周為第4月胎齡組,每月齡為一研究組,其例數(shù)分布如下:第2月齡組5例,第3月齡組6例,第4月齡組5例。

    2 方法

    2.1 取材和免疫組織化學(xué)染色程序 從胎尸內(nèi)取出小腸標(biāo)本,分別從每例標(biāo)本切取約1.0 cm長(zhǎng)腸管,用4℃生理鹽水洗凈血液,放入10%中性甲醛水溶液中固定12~24 h后,取出流水沖洗2 h,行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片,厚4μm,每個(gè)標(biāo)本取6片,行免疫組織化學(xué)(NeuN和NSE小鼠抗人單克隆抗體及其輔助試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司):免疫組織化學(xué)程序采用PV法,即切片常規(guī)脫蠟至水,微波抗原修復(fù),3%H2O2滅活內(nèi)源性酶,滴加Ⅰ抗(抗體濃度均為1∶140),滴加PV9002(山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體),DAB顯色(在以上各步之間均用PBS洗滌5 min×3次),蘇木精輕度復(fù)染,然后脫水,透明,中性樹膠封片,光鏡下觀察。

    2.2 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 用PBS替代Ⅰ抗、Ⅱ抗作陰性對(duì)照,用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。

    結(jié) 果

    切片經(jīng)免疫組織化學(xué)顯色后,NSE陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)/膜呈黃色或深黃色,細(xì)胞核不著色;NeuN陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈黃色或深黃色。

    1 NSE在小腸組織中的表達(dá)

    第2~4月齡段,人胚胎小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)的神經(jīng)元及神經(jīng)纖維呈NSE強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),腸腺內(nèi)有散在分布的NSE陽(yáng)性細(xì)胞。在小腸黏膜下層,隨著胎齡的增大,NSE陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞和纖維數(shù)量逐漸增多,見圖1。

    Figure 1.Positive NSE expression in human embryonic small intestinal myenteric nerve plexuses(★),submucosal plexuses(↑)and glands(▲)at the 2nd to 4th months of gestation(immunohistochemical staining).A,C,E:×100;B,D,F(xiàn):×400.A,B:the 2nd month of gestation;C,D:the 3rd month of gestation;E,F(xiàn):the 4th month of gestation.圖1 人胚胎第2~4月齡時(shí),NSE在小腸肌間神經(jīng)叢、黏膜下神經(jīng)叢和腺體細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)

    2 NeuN在小腸組織中的表達(dá)

    第2~4月胎齡段,人胚胎小腸黏膜層的腺體和上皮組織內(nèi)有散在NeuN陽(yáng)性細(xì)胞分布,隨著胎齡的增大,NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多,見圖2。第3月齡段開始,肌間神經(jīng)叢內(nèi)少量細(xì)胞呈NeuN陽(yáng)性表達(dá),見圖2C;隨著胎齡增大,肌間神經(jīng)叢內(nèi)NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,見圖2J。

    討 論

    小腸來(lái)源于三胚層時(shí)期的臟壁中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞,在相關(guān)基因的調(diào)控作用下,經(jīng)過(guò)細(xì)胞的增殖和凋亡逐漸演變而成。小腸是動(dòng)物和人類吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所,是消化管道重要的組成成分。其腸壁內(nèi)含有大量的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,并通過(guò)神經(jīng)纖維相互連接,形成腸神經(jīng)系統(tǒng),控制和調(diào)節(jié)小腸的分泌、吸收和運(yùn)動(dòng)。小腸黏膜層含有豐富的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞,可根據(jù)腸功能需求而分泌相應(yīng)的激素,調(diào)節(jié)黏膜層細(xì)胞的活動(dòng)。

    NeuN是具有46 kD和48 kD 2個(gè)亞型,其免疫反應(yīng)性在神經(jīng)元分化成熟后即開始表達(dá),陽(yáng)性強(qiáng)度代表神經(jīng)元發(fā)育的成熟程度[10]。NSE是烯醇化酶基因超家族成員之一,是糖酵解的關(guān)鍵酶,在糖酵解途徑中催化α-磷酸甘油生成磷酸烯醇式丙酮酸,特異地存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),對(duì)維持神經(jīng)系統(tǒng)生理功能具有重要作用。NSE的含量是成熟神經(jīng)元代謝活性和突觸化的標(biāo)志[5-8]。本研究結(jié)果顯示,第2~4月齡段人胚胎小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維均呈NSE強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。第3月齡段開始,肌間神經(jīng)叢內(nèi)少量細(xì)胞呈NeuN陽(yáng)性表達(dá),隨著胎齡增大,肌間神經(jīng)叢內(nèi)NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。上述結(jié)果說(shuō)明人胚胎小腸發(fā)育第2月齡時(shí),肌間神經(jīng)叢內(nèi)大部分細(xì)胞已能大量合成NSE,第3月齡才有少量細(xì)胞能合成NeuN,提示NSE和NeuN可能代表不同類型的成熟神經(jīng)元。NSE可以合成和分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,對(duì)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)功能。在胚胎小腸發(fā)育早期階段,NSE在肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢的廣泛表達(dá),這可能與神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化發(fā)育及突觸形成所需大量的營(yíng)養(yǎng)和信息有關(guān)。Welch等[11]報(bào)道豚鼠和大鼠出生3 d時(shí),豚鼠部分腸神經(jīng)元的胞核和胞質(zhì)呈NeuN陽(yáng)性表達(dá),而大鼠幾乎所有腸神經(jīng)元的核呈陽(yáng)性表達(dá),到了成年,肌間神經(jīng)叢內(nèi)NeuN免疫表達(dá)陽(yáng)性較弱。Sarnat等[4]通過(guò)對(duì)第8~24周人胚胎腦神經(jīng)系統(tǒng)中NeuN表達(dá)的研究,得出了隨胎齡增大,神經(jīng)元表達(dá)NeuN明顯增加。這些研究說(shuō)明NeuN在動(dòng)物和人的小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)均有表達(dá),但在表達(dá)時(shí)間、數(shù)量及分布規(guī)律上存在一定的差異,人類胚胎小腸和腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中確存在相似性。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示,第2~4月胎齡段,人胚胎小腸黏膜層的腺體和上皮組織內(nèi)有散在NeuN陽(yáng)性細(xì)胞分布,隨著胎齡的增大,NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多。腸腺和上皮內(nèi)有散在NSE陽(yáng)性細(xì)胞分布。這說(shuō)明NeuN和NSE均參與腸腺和上皮組織的發(fā)育,提示小腸上皮和腺體內(nèi)NeuN和NSE陽(yáng)性細(xì)胞可能表達(dá)于不同類型的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞,它們合成和釋放小腸黏膜層生長(zhǎng)發(fā)育所需的內(nèi)分泌激素,調(diào)控小腸黏膜層細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育。NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨著胎齡的增大而增多,可能與人胚胎小腸發(fā)育階段,腸黏膜層隨著胎齡的增大而逐漸增厚,細(xì)胞數(shù)量增多,上皮和腺體增高,其細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)的調(diào)控也隨之增加有關(guān)。

    Figure 2.Positive NeuN expression in human embryonic small intestinal villi(↑),glands(▲)and myenteric nerve plexuses(★)at the 2nd to 4th months of gestation(immunohistochemical staining).A,C,G:×100;B,D,E,F(xiàn),H,I,J:× 400.A,B:the 2nd month of gestation;C~F:the 3rd month of gestation;G~J:the 4th month of gestation.圖2 人胚胎第2~4月齡時(shí),NSE在小腸絨毛、腺體和肌間神經(jīng)叢細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)

    綜上所述,人胚胎小腸發(fā)育第2~4月齡段,NeuN主要表達(dá)于腸黏膜上皮和腺體,調(diào)控黏膜層細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。NSE主要表達(dá)于腸肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢,調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。NeuN和NSE參與腸壁不同類型細(xì)胞的發(fā)育成熟過(guò)程。

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