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      急性白血病細胞系中SFRP基因啟動子甲基化及去甲基化誘導(dǎo)表達的研究

      2013-12-01 02:28:58徐成波皇甫真萍陳毅寧陳佳薇沈建箴
      中國病理生理雜志 2013年8期
      關(guān)鍵詞:甲基化產(chǎn)物引物

      徐成波, 馮 敏, 廖 斌, 皇甫真萍, 齊 彥, 陳毅寧, 陳佳薇, 沈建箴

      (1福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科,福建福州350004;2福建省立醫(yī)院北院,福建省老年醫(yī)院內(nèi)分泌科,福建福州350001;3福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科,福建福州350001)

      Wnt信號通路的過度激活參與了人類多種腫瘤的形成,被認為是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵信號通路。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related protein,SFRP)作為Wnt信號通路的胞外拮抗物,能通過多種機制抑制經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt通路[1],阻斷異常激活的Wnt信號,促進腫瘤細胞凋亡,達到抑制腫瘤的形成與發(fā)展。為了探討SFRP基因家族啟動子CpG島異常甲基化狀態(tài)在急性白血病(acute leukemia,AL)發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究擬采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)的方法檢測白血病細胞系和不同濃度的5-氮雜-2’-脫氧胞苷酸(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)作用下 Jurkat細胞中 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因啟動子區(qū)的甲基化,并檢測 SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)1、DNMT3A 和 DNMT3B mRNA表達的變化,以期從表觀遺傳學(xué)水平揭示AL的發(fā)病機制。

      材料和方法

      1 材料

      實驗用急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)細胞為Molt-4和 Jurkat細胞,急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)細胞為HL-60和NB4細胞,均由福建省血液病研究所傳代保存。

      小牛血清(杭州四季青公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco);5-Aza-CdR、蛋白酶K、RNA酶、亞硫酸氫鈉和氫醌(Sigma);淋巴細胞分離液和酚-氯仿DNA抽提液(上海生物工程公司);焦碳酸二乙酯(DEPC)和Trizol試劑(上海生物工程公司);Wizard DNA樹酯純化試劑盒(Promega);Platinum? SYBR? Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒(Invitrogen);2×Taq PCR Master Mix試劑(北京博邁德生物公司);DNA marker(廈門鷺隆生物有限公司)。引物由Invitrogen合成。

      37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱(Heal Force);DU-640紫外分光光度儀(Beckman Coulter);Gel Doc 1000凝膠圖像分析儀(Bio-Rad);7700型PCR擴增儀和7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

      2 方法

      2.1 細胞培養(yǎng)及干預(yù)實驗 所用AL細胞均常規(guī)復(fù)蘇后,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(pH 7.2),于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天傳代1次,實驗用細胞為對數(shù)生長期細胞。SFRP基因去甲基化實驗中,取對數(shù)生長期的Jurkat細胞,調(diào)整細胞濃度為1×109/L,并接種于培養(yǎng)瓶中,未處理組細胞即不加藥培養(yǎng)72 h作為空白對照,其余分別加入5-Aza-CdR 1μmol/L、2μmol/L和4μmol/L處理,共培養(yǎng)72 h,用藥結(jié)束后,收集各組細胞,進行DNA和RNA的提取,用于進一步的研究。

      2.2 正常人骨髓或外周血單個核細胞的提取 骨髓穿刺檢查或抽取外周血時,留取骨髓標本或外周血2 mL,肝素抗凝。在離心管中加入2倍體積的淋巴細胞分離液,顛倒混勻。將骨髓標本或血標本離心20 min。離心后,上層為血清,中間層為單個有核細胞,下層為紅細胞和血小板。小心吸取中間層的單個核細胞,洗滌離心后備用。

      2.3 細胞基因組DNA的提取 收集各實驗組細胞以及正常人骨髓或外周血單個核細胞,常規(guī)酚-氯仿法提取細胞基因組DNA,并通過紫外分光光度儀鑒定其含量及純度。用去離子水溶解后于-20℃保存。

      2.4 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾與純化 參考Herman等[2]的方法并加以改進,取1~2μg DNA溶解于50μL去離子水中,加3 mol/L NaOH 5.5μL,37℃水浴30 min。向堿變性的DNA中加入新配置的10 mmol/L氫醌30μL和3 mol/L亞硫酸氫鈉520 μL,以礦物油3滴覆蓋液面,50℃水浴16 h。再用Wizard DNA Clean-Up System純化,純化后的DNA加3 mol/L NaOH 5.5μL,室溫放置15 min,用預(yù)冷的70%乙醇沉淀DNA,并以30μL去離子水溶解,-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

      2.5 MSP檢測 取經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后的DNA 3 μL為模板,采用25μL體系進行擴增,體系包含12.5μL的2×Taq PCR Master Mix,甲基化或非甲基化的上、下游引物各0.5μL,補足水至25μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min,95℃ 45 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個循環(huán),72℃ 10 min。同時,以修飾后的正常人骨髓或外周血單個核細胞DNA為非甲基化陰性對照,將已經(jīng)證實均存在 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因高甲基化的人結(jié)直腸癌細胞系RKO細胞DNA為甲基化陽性對照[3],H2O作空白對照。將PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠圖像分析儀上自動分析成像。應(yīng)用甲基化引物擴增出基因甲基化產(chǎn)物的細胞,定為該基因完全甲基化;應(yīng)用非甲基化引物擴增出基因非甲基化產(chǎn)物的細胞,定為該基因完全非甲基化;同時可擴增出甲基化和非甲基化產(chǎn)物的細胞,定為該基因部分甲基化。

      2.6 實時熒光定量RT-PCR檢測SFRP mRNA的表達水平 各組細胞至培養(yǎng)終點后以Trizol試劑一步法提取細胞總RNA,并鑒定RNA的完整性。以2μg RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,實時定量RT-PCR采用7500型熒光定量PCR儀和Platinum? SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒進行PCR擴增,以GAPDH為內(nèi)參照。采用與GAPDH比較Ct值的方法來定量mRNA表達水平,實驗重復(fù)3次。

      2.7 半定量RT-PCR檢測DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達水平 采用7700型PCR擴增儀和2×Taq PCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增,以GAPDH為內(nèi)參照,將PCR產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠圖像分析儀上自動分析成像,以目的條帶與GAPDH條帶的吸光度比值進行半定量分析,實驗重復(fù)3次。

      3 統(tǒng)計學(xué)處理

      計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      結(jié) 果

      1 AL細胞系中SFRP基因的甲基化狀態(tài)

      在 Molt-4、Jurkat、HL-60 和 NB4 細胞中,應(yīng)用甲基化引物可擴增出的 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化產(chǎn)物特異性條帶,同時應(yīng)用非甲基化引物在HL60細胞中可擴增出SFRP4基因的非甲基化產(chǎn)物,表明 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因在Molt-4、Jurkat和NB4細胞中均呈完全甲基化狀態(tài),而 HL-60細胞中 SFRP1、SFRP2和SFRP5呈完全甲基化狀態(tài),而SFRP4基因呈部分甲基化狀態(tài),見圖1。正常人骨髓或外周血單個核細胞應(yīng)用非甲基化引物可擴增出SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的非甲基化特異性條帶,而甲基化引物不能擴增出特異性產(chǎn)物,表明正常人細胞中SFRP基因均呈非甲基化狀態(tài)。

      Figure 1.MSP analysis of SFRP1,SFRP2,SFRP4 and SFRP5 genes in Molt-4,Jurkat,HL-60 and NB4 cell lines.M:methylated;U:unmethylated;NC:negative control;PC:positive control;H2 O:blank control.圖1 4種AL細胞中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化分析

      2 SFRP2基因甲基化MSP產(chǎn)物的序列分析

      為了證實MSP分析基因甲基化的可靠性,隨機挑選了SFRP2基因甲基化引物擴增的PCR產(chǎn)物,經(jīng)T-A克隆后測序。測序結(jié)果證明該MSP產(chǎn)物是野生型(wild-type)SFRP2基因啟動子區(qū)的部分序列,其分析結(jié)果完全可靠。甲基化的SFRP2基因,其CpG島二核苷酸中的胞嘧啶(C)堿基未被亞硫酸氫鹽硫化改變,仍為C堿基;而在非CpG島中的C堿基經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后都轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶(T)堿基,見圖2。

      Figure 2.Sequence analysis of the MSPproduct of methylated SFRP2 gene after bisulfite treatment.Wild-type cytosine(C)residues that were methylated in CpGislands(framed)remained unchanged,and Cresidues that were unmethylated were changed to thymidine(T)by bisulfite-induced deamination(underlined).圖2 SFRP2基因甲基化MSP產(chǎn)物的序列分析

      3 Jurkat細胞經(jīng)5-Aza-Cd R處理后SFRP基因甲基化水平的改變

      用不同濃度5-Aza-CdR處理Jurkat細胞72 h后,MSP分析顯示,隨著5-Aza-CdR濃度的升高,SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化水平(吸光度值)逐漸降低,見圖3,提示SFRP基因的高甲基化狀態(tài)被逆轉(zhuǎn)。

      Figure 3.MSPanalysis of SFRP genes in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR for 72 h.圖3 5-Aza-Cd R處理Jurkat細胞后SFRP基因甲基化水平的變化

      4 Jurkat細胞經(jīng)5-Aza-Cd R處理后SFRP mRNA表達水平的改變

      4 μmol/L 5-Aza-CdR 組中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5 mRNA表達水平均明顯升高,分別是未處理組中表達水平的4.6、3.5、2.3和4.2倍(均P<0.01),見圖4,提示SFRP基因的高甲基化狀態(tài)被逆轉(zhuǎn)后,甲基化沉默的SFRP基因被激活轉(zhuǎn)錄。

      Figure 4.The mRNA expression levels of SFRP in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR at the concentration of 4 μmol/L.Mean±SD.n=3.**P <0.01 vs control.圖4 5-Aza-CdR處理Jurkat細胞72 h后SFRP mRNA表達水平的變化

      5 Jurkat細胞經(jīng)5-Aza-Cd R處理后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達水平的變化

      半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),隨著5-Aza-CdR濃度升高以及SFRP基因甲基化水平的降低,DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達水平均有下調(diào),且呈劑量依賴性,各藥物作用組與未處理組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

      Figure 5.Semiquatitative RT-PCR analysis of DNMT1,DNMT3A and DNMT3B mRNA expression in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR for 72 h.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs 0μmol/L.圖5 5-Aza-CdR處理Jurkat細胞后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達水平的變化

      討 論

      DNA甲基化是真核生物基因組最常見的一種表觀遺傳學(xué)修飾方式,它對X染色體滅活[4]、基因組印跡[5]、DNA 修復(fù)[6]和基因表達調(diào)控[7]等起著非常重要的作用?;蚪M特定序列的低甲基化或高甲基化都會使基因的表達發(fā)生變化。大約90%的DNA甲基化發(fā)生在啟動子區(qū)的CpG島,正常生理條件下絕大部分啟動子CpG島均處于非甲基化狀態(tài),一旦基因的CpG島發(fā)生高甲基化將直接導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄失活。

      Wnt信號通路調(diào)控著細胞的增殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等許多生命過程[8]。研究表明,Wnt異常信號通路激活癌癥的重要機制是一種或多種可溶性Wnt抑制基因的甲基化沉默所致,SFRP作為Wnt信號通路的負調(diào)控因子,其基因表達下調(diào)可引起Wnt信號通路持續(xù)異常激活,從而最終引起包括胃腸道腫瘤、黑色素瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌及間皮瘤等腫瘤的發(fā)生,被認為是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵信號通路[9]。

      SFRP作為Wnt信號途徑的“門戶”,在正常情況下能有效地抑制Wnt途徑的異常激活。但是,在SFRP基因發(fā)生甲基化沉默后則失去這種作用[10]。Chim等[11]利用骨髓瘤細胞株及原發(fā)性骨髓瘤標本研究Wnt信號通路的激活情況,發(fā)現(xiàn)在4組細胞株中,LP1及WL2細胞株存在Wnt信號的異常激活,且與多種Wnt抑制基因超甲基化沉默有關(guān),去甲基化后抑制基因可重新恢復(fù)表達,Wnt通路活化水平也開始下調(diào)。同時,在初發(fā)多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者中,有42%的患者存在至少一種抑制基因的甲基化,其中61.9%有2種以上抑制基因的甲基化。Jost等[12]對76例初治MM患者的SFRP基因進行甲基化檢測,發(fā)現(xiàn)有35.5%的 SFRP1、52.6%的SFRP2、1.3%的SFRP4和6.9%的SFRP5存在高甲基化,而且SFRP5的高甲基化可能與疾病的進展有關(guān)。Liu等[13]在對20例慢性B淋巴細胞白血病患者的研究中發(fā)現(xiàn),SFRP基因普遍存在DNA甲基化沉默,SFRP1、SFRP2和SFRP5基因基因的甲基化比率分別是100%、55%、30%和15%。

      本研究應(yīng)用 MSP技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),SFRP1、SFRP2、SFRP4 和 SFRP5 基因在 Molt-4、Jurkat和NB4細胞中均呈完全甲基化狀態(tài),而HL-60細胞中SFRP1、SFRP2和SFRP5基因呈完全甲基化狀態(tài),SFRP4基因呈部分甲基化狀態(tài),因此推測,SFRP基因在AL中發(fā)生高頻率甲基化。

      白血病的DNA去甲基化治療已成為AL治療研究的新熱點[14]。去甲基化藥物5-Aza-CdR是美國FDA批準的第一批用于治療MDS的表觀遺傳藥物。5-Aza-CdR過去主要作為抗腫瘤細胞毒藥物使用,阻斷細胞向S期轉(zhuǎn)化。本實驗發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR作用Jurkat細胞72 h后,隨著藥物終濃度的增加,SFRP mRNA的表達水平隨著甲基化程度的降低而增高,這表明SFRP基因去甲基化后重新恢復(fù)表達。與此同時,DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達水平也呈劑量依賴性的表達下調(diào)。由于5-Aza-CdR是核苷類似物,磷酸化后能與DNMT形成共價復(fù)合物,抑制其與DNA結(jié)合發(fā)揮甲基化活性,從而誘導(dǎo)DNA去甲基化[15]。因此,推測5-Aza-CdR可能通過抑制DNMT表達,阻斷DNMT轉(zhuǎn)移S-腺苷蛋氨酸的甲基于CpG島的5-胞嘧啶上而逆轉(zhuǎn)DNA啟動子區(qū)CpG島的甲基化,重新激活因高甲基化而處于沉默的SFRP基因,而達到去甲基化激活轉(zhuǎn)錄的作用。但是由于5-Aza-CdR對基因的去甲基化作用缺乏細胞特異性,它在治療異常甲基化的同時,可能會引起處于抑制狀態(tài)的某些基因恢復(fù)活性,導(dǎo)致正?;蛘{(diào)控機制的紊亂,所以5-Aza-CdR廣泛應(yīng)用于臨床還需要進一步的探索。

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