三帶喙庫(kù)蚊抗性水平與其對(duì)乙腦病毒易感性關(guān)系的研究*

吳治明 汪中明 李春曉 郭曉霞 閻 婷王 剛 朱小娟 張恒端 董言德 趙彤言**

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥 230032；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis，乙腦)是由蚊蟲傳播的病毒性疾病，主要引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。它的病原體是黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)的乙型腦炎病毒( Japanese encephalitis virus， JEV )。我國(guó)除新疆、西藏、青海外均為乙腦疫區(qū)，主要病例發(fā)生在兒童，病死率較高，后遺癥嚴(yán)重，目前雖已有疫苗可供預(yù)防，但局部地區(qū)仍時(shí)有暴發(fā)或流行(郭楊等，2008；郭海強(qiáng)等，2011)，對(duì)媒介蚊蟲的控制仍是預(yù)防乙腦的關(guān)鍵措施。

三帶喙庫(kù)蚊Culextritaeniorhynchus是我國(guó)乙腦的主要傳播媒介(王逸民等，1990)。在媒介蚊蟲的防治中，化學(xué)防治因具有實(shí)施方便、見(jiàn)效快等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用(陸寶麟，2000)。三帶喙庫(kù)蚊孳生地多為稻田，廣泛接觸農(nóng)業(yè)用殺蟲劑，由于殺蟲劑的連續(xù)大量使用，加之蚊蟲世代歷期短、繁殖力強(qiáng)等因素，導(dǎo)致了三帶喙庫(kù)蚊抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。目前我國(guó)很多地區(qū)三帶喙庫(kù)蚊已經(jīng)對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性(周明浩等，2006；劉洪霞等，2008；孫養(yǎng)信等，2009a，2009b，2011；楊維芳等，2011)。

隨著對(duì)多種與蚊蟲抗性相關(guān)解毒代謝酶類的深入研究，已分離和鑒定出多種與抗性相關(guān)的基因，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，蚊蟲往往從多個(gè)生理途徑進(jìn)化出一系列復(fù)雜的機(jī)制來(lái)抵御某種藥物侵害(McCarrolletal.， 2001；Hemingwayetal.， 2000a；崔峰等， 2007)，而這些機(jī)制的產(chǎn)生會(huì)給蚊蟲帶來(lái)某些生理生化特性的改變。對(duì)致倦庫(kù)蚊敏感品系和抗性品系的研究發(fā)現(xiàn)，抗性蚊蟲的酯酶在中腸、真皮層、馬氏管、唾液腺等組織中高量表達(dá)，改變了細(xì)胞的氧化還原能力(Hemingwayetal.， 2000b)。細(xì)胞氧化還原能力的改變，可能會(huì)改變中腸結(jié)構(gòu)細(xì)胞表面電荷的分布從而阻止病毒對(duì)細(xì)胞的感染及病毒穿過(guò)中腸向血淋巴的釋放，最終會(huì)影響蚊蟲的媒介效能。研究還發(fā)現(xiàn)，擬除蟲菊酯抗性蚊蟲通過(guò)升高谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶含量來(lái)減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，使昆蟲組織免受氧化性損傷，可能會(huì)有利于病原體的存活；相反，P450單加氧酶含量的升高，增加細(xì)胞的氧化作用而不利于病原體的存活(Vontasetal.， 2001)。這些研究表明殺蟲劑抗性的產(chǎn)生，有可能促進(jìn)或抑制疾病的傳播。

本研究通過(guò)野外采集不同種群三帶喙庫(kù)蚊，測(cè)定其對(duì)兩種常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性水平，同時(shí)進(jìn)行乙型腦炎病毒的感染實(shí)驗(yàn)。以期了解自然環(huán)境中三帶喙庫(kù)蚊抗藥性水平與其對(duì)乙腦病毒的易感性之間的關(guān)系，對(duì)乙腦的防治具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)蟲株: 三帶喙庫(kù)蚊的實(shí)驗(yàn)室品系(LAB)由陜西省疾病預(yù)防控制中心引進(jìn)，野外采集后連續(xù)飼養(yǎng)3年多，未接觸任何殺蟲劑。野外種群是在2011年7～8月采集的陜西安康建民種群(AKJM)(32°42′57″N，108°56′42″E)、江蘇南京江浦種群(NJJP)(32°01′18″N，118°28′54″E)和安徽濉溪南坪種群(SXNP)(33°50′16″N，116°88′53″E)。采集場(chǎng)所均為養(yǎng)豬場(chǎng)，用電動(dòng)吸蚊器多次采集飽血后的三帶喙庫(kù)蚊成蚊，帶回養(yǎng)蟲室產(chǎn)卵孵化，利用繁殖的第1代(安康建民種群有F1和F3代)進(jìn)行生物測(cè)定和感染實(shí)驗(yàn)。養(yǎng)殖條件：溫度26±1 ℃、相對(duì)濕度75%±5%、光照14 h/d。

1.1.2實(shí)驗(yàn)用鼠：昆明(KM)乳鼠，1～3日齡時(shí)對(duì)病毒最敏感，用于病毒的鼠腦傳代； KM小鼠，成年，用于采新鮮鼠血，以上實(shí)驗(yàn)用昆明鼠均購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3病毒：乙型腦炎病毒(GenBank No.L48961)毒種由本所菌毒種保藏中心提供。

1.1.4質(zhì)粒和菌株:pMD18-T Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；宿主菌大腸桿菌E.coliXL1-blue，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.5工具酶和主要試劑:溴氰菊酯(98.7%)和高效氯氰菊酯(99.0%)購(gòu)自北京市和力順科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、Premix Version 2.0(Loading dye mix)、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL 2000和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，IPTG和X-gal購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈?gòu)自北京博大泰克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1幼蟲半數(shù)致死濃度(LC50值)測(cè)定:對(duì)實(shí)驗(yàn)室品系及野外種群的幼蟲做毒力測(cè)定。采用浸漬法(劉維德，1983)，將殺蟲劑母液用丙酮配制成5～7個(gè)濃度，容器中加199 mL過(guò)夜清水，放入30頭Ⅲ齡末Ⅳ齡初幼蟲，加1 mL不同梯度濃度的藥液，1 mL丙酮作對(duì)照，重復(fù)3次，24 h后觀察結(jié)果，以幼蟲不能逃避機(jī)械刺激為死亡。將存活個(gè)體在-70 ℃條件下保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，記錄處理蟲數(shù)。通過(guò)分析獲得致死中濃度LC50值及其95%置信限(95% CI)。由于實(shí)驗(yàn)室品系三帶喙庫(kù)蚊未完全回復(fù)到敏感狀態(tài)，三帶喙庫(kù)蚊敏感品系幼蟲對(duì)常用殺蟲劑的LC50值參考以往文獻(xiàn)記錄數(shù)值(表1)(陳美文，1984; 張淑媛，1993)。

1.2.2三帶喙庫(kù)蚊經(jīng)口感染乙腦病毒: (1)10%病毒鼠腦懸液的制備：取1窩1～3日齡的健康KM乳鼠，腦內(nèi)接種病毒，每只0.03 mL，接種完成后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，24 h內(nèi)無(wú)非特異性死亡。逐日觀察乳鼠生長(zhǎng)情況，待乳鼠出現(xiàn)散窩、抽搐、弓背等發(fā)病癥狀，用75%酒精對(duì)發(fā)病乳鼠體表消毒后進(jìn)行無(wú)菌解剖取鼠腦，加入DMEM培養(yǎng)液冰上研磨，制成10%的病毒鼠腦液(每個(gè)鼠腦重量約為0.2 g)，12 000 r/min，離心10 min，取上清為病毒鼠腦懸液，沉淀作為陽(yáng)性樣本，于-70℃凍存。(2)經(jīng)口感染：在感染實(shí)驗(yàn)前一晚將一定量羽化3～5 d的三帶喙庫(kù)蚊吸入小蚊籠中，斷糖水。取成年的健康KM鼠，眼球取血共4 mL，加入1%的肝素鈉抗凝劑防止凝血。將病毒鼠腦懸液、新鮮鼠血、8%過(guò)濾糖水按1∶1∶1體積配成12 mL病毒血餐，37℃水浴，另配制一份由DMEM培養(yǎng)液替代病毒鼠腦懸液的血餐，作為陰性對(duì)照。將海綿剪成適當(dāng)大小，浸透血餐后盛放于小平皿中，放入小蚊籠中供蚊子吸血1 h。將小蚊籠放入手套隔離器中，挑選飽血雌蚊放入透明塑料杯中，以細(xì)密紗布封口，1只/杯。于26±1℃，相對(duì)濕度75%±5%，光照14 h/d環(huán)境中，以3%的糖水喂養(yǎng)，10 d后收樣。將隔離器中剩余的蚊蟲凍死，挑出飽血雌蚊凍存于-70℃，標(biāo)記為0 d樣本。陰性對(duì)照組的蚊蟲直接飼育10 d后收樣。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)病毒核酸：(1)引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)文獻(xiàn)資料 (方美玉等，1997)，使用Primer primier 6.0軟件，設(shè)計(jì)了1對(duì)乙腦病毒通用引物。上游引物P101：5′-GTCAACCCCATAACTCTCACAGC-3′，下游引物P102：5′-ACGCAGAGGACTAGGAGCATTAC-3′，目的片段長(zhǎng)度為1 227 bp。引物由賽百盛生物工程公司合成，用無(wú)RNA酶的水配成10 μmol/L應(yīng)用濃度，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?2)成蚊總RNA的提取:取單頭雌蚊，采用Invitrogen公司Trizol試劑提取三帶喙庫(kù)蚊總RNA(按操作手冊(cè)進(jìn)行)。提取的總RNA溶解于適量DEPC處理的無(wú)菌水中，立即進(jìn)入cDNA第1鏈的合成。(3)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT反應(yīng)): 反應(yīng)體積20 μL，其中蚊RNA 2 μL ，25 mmol/L MgCl24 μL，10×RT Buffer 2 μL，RNase Free ddH2O 7.5 μL，各10 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，200 U/μL AMV Reverse Transcriptase 1 μL，50 pmol/μL Random 9 mol/μL，按以下條件進(jìn)行：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min，95 ℃，5 min；5 ℃，5 min。立即進(jìn)入PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 (4) PCR擴(kuò)增: 反應(yīng)總體積 50 μL，包括cDNA模板(RT反應(yīng)產(chǎn)物)4 μL，Premix Taq 25 μL，10 mmol/L P101 2.0 μL，10 mmol/L P102 2.0 μL，ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件為: 94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。(5) PCR 產(chǎn)物純化：按Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0 試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)說(shuō)明書純化回收PCR 產(chǎn)物。(6)克隆并測(cè)序：PCR純化產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化宿主菌XL-blue 1，在X-Gal和IPTG的存在下，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選，PCR鑒定及酶切鑒定，挑選陽(yáng)性克隆菌液送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，將所得的核酸序列進(jìn)行去載體、拼接、去冗余處理后，將結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中的部分已知物種核酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)。(7)電泳檢測(cè)陽(yáng)性樣本：以DNA DL2000 Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，記錄陽(yáng)性樣本數(shù)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)與計(jì)算：用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，記錄處理蟲數(shù)。通過(guò)分析獲得致死中濃度(LC50值)及其95%置信限(95%CL)、斜率值(slope)、標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)、卡方值(χ2)、自由度(df)。計(jì)算抗性指數(shù)，抗性指數(shù)(R/S)=野外種群LC50/參考敏感品系LD50。

2 結(jié)果

2.1 三帶喙庫(kù)蚊幼蟲對(duì)兩種常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑的生物測(cè)定結(jié)果

本研究采用浸漬法，測(cè)定了各種群三帶喙庫(kù)蚊幼蟲對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的半數(shù)致死濃度(LC50值)。結(jié)果表明，三帶喙庫(kù)蚊幼蟲實(shí)驗(yàn)室品系、南京江浦種群F1代、濉溪南坪種群F1代、安康建民種群F1代和F3代對(duì)溴氰菊酯的LC50值分別為0.0009、0.0071、0.0160、0.0027和0.0025 mg/L，與參考的敏感品系數(shù)據(jù)相比，抗藥性指數(shù)從2.30至40.05倍不等；對(duì)高效氯氰菊酯的LC50值分別為0.0043、0.0117、0.0528、0.0121和0.0141 mg/L，與參考的敏感品系數(shù)據(jù)相比，抗藥性指數(shù)從2.13～26.42倍不等?？梢?jiàn)，各自然種群三帶喙庫(kù)蚊幼蟲對(duì)兩種殺蟲劑均產(chǎn)生了不同程度的抗性(表1)。

2.2 各地三帶喙庫(kù)蚊對(duì)乙腦病毒的易感性

采用經(jīng)口感染的方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室品系和3個(gè)野外種群的三帶喙庫(kù)蚊進(jìn)行了乙腦病毒的感染實(shí)驗(yàn)。三帶喙庫(kù)蚊吸食7.3 logPFU/mL 的乙腦病毒血餐10 d后，用RT-PCR方法檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)病毒，檢測(cè)的片段經(jīng)克隆、測(cè)序比對(duì)之后確定為乙腦病毒。結(jié)果顯示：三帶喙庫(kù)蚊實(shí)驗(yàn)室品系、南京江浦種群F1、濉溪南坪種群F1代、安康建民種群F1代和F3代對(duì)乙腦病毒感染率分別為84.44%、80.56%、62.50%、86.00%和91.89%(圖1，表2)。

2.3 三帶喙庫(kù)蚊抗性水平與其對(duì)乙腦病毒易感性的相關(guān)性分析

將三帶喙庫(kù)蚊對(duì)兩種常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性指數(shù)與其對(duì)乙腦病毒的感染率作相關(guān)性分析，得到如下結(jié)果：三帶喙庫(kù)蚊幼蟲對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的抗性水平與其對(duì)乙腦病毒的易感性的相關(guān)性明顯。其中三帶喙庫(kù)蚊對(duì)乙腦病毒的感染率越低，其幼蟲對(duì)溴氰菊酯的抗性指數(shù)越高(P=0.0167<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.887，回歸方程為：y=-1.295x+119.5(圖2)；同樣，對(duì)乙腦病毒的感染率越低，其對(duì)高效氯氰菊酯的抗性指數(shù)也越高(P=0.0460<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.783，回歸方程為：y=-0.765x+71.52(圖3)。

表1 各種群三帶喙庫(kù)蚊對(duì)2種常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑的致死中濃度(LC50)測(cè)定及抗藥性指數(shù)Tab.1 Resistance characteristics(LC50&R/S) of the different populations of Culex tritaeniorhynchus larva

注：SS：參考敏感品系；LAB：實(shí)驗(yàn)室種群；NJJPF1：南京江浦種群F1代；AKJMF1：安康建民種群F1代；AKJMF3：安康建民種群F3代；SXNPF1：濉溪南坪種群F1代。抗性指數(shù)(R/S)=野外種群LC50/參考敏感品系LD50。下同。

Note:RS:Reference sensitive population；LAB:Laboratory population；NJJPF1:F1 of Nanjing jiangpu population；AKJMF1:F1 of Ankang jianmin population；AKJMF3:F3 of Nanjing jiangpu population；SXNPF1: F1 of Suixi nanping population. Resistant ratio(R/S)=LC50of Resistant strain/LC50of sensitive strain. The same below.

圖1 感染實(shí)驗(yàn)中三帶喙庫(kù)蚊樣本感染乙腦病毒(JEV)的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of Japanese encephalitis virus in Culex tritaeniorhynchusM：DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：JEV鼠腦懸液；2：正常三帶喙庫(kù)蚊(陰性對(duì)照)；3：感染JEV 0 d的三帶喙庫(kù)蚊；4，5，6：感染JEV 10 d的三帶喙庫(kù)蚊.M： DL2000 DNA Marker；1：Mix liquid with Japanese encephalitis virus；2：Normal Cx. tritaeniorhynchus；3：Cx. tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus 0 day；4，5，6：Cx. tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus 10 days later.

表2 三帶喙庫(kù)蚊成蚊對(duì)乙腦病毒的易感性Tab.2 Susceptibility of Culex tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus

感染率=陽(yáng)性個(gè)體數(shù)/檢測(cè)個(gè)體總數(shù)×100%。

Infection rate=number of positive individuals/total number of detection individuals×100%.

圖2 三帶喙庫(kù)蚊幼蟲對(duì)溴氰菊酯抗藥性指數(shù)與其對(duì)乙腦病毒感染率的相關(guān)性Fig.2 Correlation relationship between R/S of larval mosquito to deltapermethrin and infection rate of Culex tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus(P=0.0167)

圖3 三帶喙庫(kù)蚊幼蟲對(duì)高效氯氰菊酯抗藥性指數(shù)與其對(duì)乙腦病感染率的相關(guān)性Fig.3 Correlation relationship between R/S of larval mosquito to beta-cypermethrin and infection rate of Culex tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus(P=0.0460)

3 討論

蚊蟲抗性的發(fā)生和發(fā)展受遺傳、生物學(xué)、藥劑和環(huán)境等方面因素的影響(唐振華等，2000；Nkyaetal.， 2013)。在多種因素共同作用下，蚊蟲對(duì)于殺蟲劑的抗性水平千差萬(wàn)別。本研究根據(jù)對(duì)我國(guó)少數(shù)幾個(gè)地區(qū)三帶喙庫(kù)蚊幼蟲生物測(cè)定的結(jié)果，結(jié)合以往各地的調(diào)查數(shù)據(jù)(周明浩等，2006；劉洪霞等，2008；孫養(yǎng)信等，2009a，2009b，2011；楊維芳等，2011)表明：我國(guó)許多地區(qū)的三帶喙庫(kù)蚊已經(jīng)對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度抗性。具體表現(xiàn)為不同種類殺蟲劑的抗性水平不同，對(duì)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類殺蟲劑抗性水平較高，對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性水平相對(duì)較低；不同地理種群三帶喙庫(kù)蚊對(duì)同一種殺蟲劑的抗性水平不同，可能與殺蟲劑的使用劑量和頻率有關(guān)。

媒介蚊蟲對(duì)蟲媒病毒的易感性受到包括蚊蟲的遺傳背景因素、蟲媒病毒的因素(滴度、毒力和血清型等)、環(huán)境因素(溫度、濕度等)、蚊蟲營(yíng)養(yǎng)和個(gè)體大小等多種因素的影響(周光智等，2003)。蚊蟲在長(zhǎng)期的化學(xué)殺蟲劑選擇壓力下，已從多個(gè)生理途徑進(jìn)化出抵抗這種選擇壓力的能力，而且這種能力是可以遺傳的。根據(jù)抗性分子機(jī)制不同，蚊蟲抗藥性主要分為代謝解毒和靶標(biāo)敏感。參與解毒代謝的酶類主要通過(guò)基因擴(kuò)增和活性升高等方式抵抗殺蟲劑，而靶標(biāo)蛋白類主要通過(guò)基因突變，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的方式抵抗殺蟲劑的作用。這些改變發(fā)生的同時(shí)，也改變細(xì)胞表面電荷的分布和神經(jīng)遞質(zhì)的正常傳遞，影響了蚊蟲細(xì)胞的氧化還原能力，改變了蚊蟲的生理生化功能(崔峰等， 2007)。蚊蟲生理生化功能的改變，可能促進(jìn)或抑制其對(duì)疾病的傳播。因此，在媒介蚊蟲的防治中，了解抗藥性對(duì)蚊蟲媒介效能的影響就顯得尤為重要。

由于自然環(huán)境中蚊蟲接觸的殺蟲劑種類繁多，其抗藥性的產(chǎn)生是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，通過(guò)研究野外種群三帶喙庫(kù)蚊抗性水平與其對(duì)乙腦病毒易感性的相關(guān)性，更能反映自然環(huán)境中的真實(shí)情況。我們的研究結(jié)果顯示：各野外種群三帶喙庫(kù)蚊幼蟲對(duì)溴氰菊酯的抗性指數(shù)越高，其對(duì)乙腦病毒的感染率越低(P=0.0167<0.05)；對(duì)高效氯氰菊酯的抗性指數(shù)越高，其對(duì)乙腦病毒的感染率也越低(P=0.0460<0.05)。表明三帶喙庫(kù)蚊在殺蟲劑的選擇壓力下，其對(duì)乙腦病毒的易感性可能會(huì)受到一定的影響，但這種影響的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。