涼血止血法與活血通絡(luò)法調(diào)節(jié)RVO兔模型凝血因子及微循環(huán)作用機(jī)制的研究

吳 烈桑子瑾唐 棠夏燕婷吳建國張 楠馬菊梅康 瑋楊迎新張國亮武丹蕾

2北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院

3北京中醫(yī)藥大學(xué)

4中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是繼糖尿病視網(wǎng)膜病變之后第二位最常見的視網(wǎng)膜血管病，也是我國主要的致盲眼病之一。RVO的病因病機(jī)十分復(fù)雜，屬于難治之證，西醫(yī)尚無特效療法。該病屬中醫(yī)“血證”范疇，臨床以《血證論》“治血四法”為理論指導(dǎo)采用涼血止血法及活血通絡(luò)法取得良好療效。但兩法在治療過程中如何協(xié)同作用，作用有何不同，并沒有十分精準(zhǔn)的闡述，作用機(jī)制也尚未闡明。本研究采用光化學(xué)方法建立的RVO兔模型，選擇功效涼血止血的十灰散，以及功效活血化瘀、兼以行氣通絡(luò)的血府逐瘀湯進(jìn)行干預(yù)。通過觀察微循環(huán)及凝血相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)，探討涼血止血法及活血通絡(luò)法在RVO治療中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭白兔39只，雌雄不限，體重2.3 kg～2.5 kg，兔齡 12～16 個(gè)月，健康無眼疾，普通級(jí)環(huán)境分籠飼養(yǎng)。所有動(dòng)物由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要藥物：十灰散：大薊、小薊、荷葉、側(cè)柏葉、茅根、茜根、山梔、大黃、牡丹皮、棕櫚皮。血府逐瘀湯：當(dāng)歸、生地、桃仁、紅花、枳殼、赤芍、柴胡、甘草、桔梗、川芎、牛膝。水煎制成濃縮液，劑量相當(dāng)于臨床劑量2倍，參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》與人折算。

1.1.3 主要試劑：孟加拉玫紅（Sigma公司），TXB2及6-Keto-PGF1α放免試劑盒、ATⅢ及PLG試劑盒 （北京華英生物技術(shù)研究所提供），熒光素鈉注射液。

1.1.4 主要儀器：眼底照相機(jī)、熒光素眼底血管造影儀、倍頻Nd：YAG激光儀、r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀、ACL TOP全自動(dòng)血凝分析儀（北京華英生物技術(shù)研究所提供）。

1.2 方法

1.2.1 分組方法：將39只實(shí)驗(yàn)兔以完全隨機(jī)法分為4組。正常組3只（6眼）不造模，予生理鹽水；其余4組各9只（18眼）建立RVO模型：模型組予生理鹽水，止血組予十灰散，活血組予血府逐瘀湯，止血＋活血組予十灰散合血府逐瘀湯。

1.2.2 造模方法：麻醉后經(jīng)耳緣靜脈注射30 g/L（50 mg/kg）孟加拉玫紅溶液，應(yīng)用氪-綠激光（波長530 nm、能量300 mW、光斑直徑100 μm、持續(xù)時(shí)間 0.2 s）距離視盤1 PD進(jìn)行光凝，避開伴行動(dòng)脈，光凝靜脈選定點(diǎn)的兩側(cè)，見靜脈收縮后再光凝中央，形成一段約1/3 PD的靜脈阻塞區(qū)域，觀察靜脈血流逐漸變慢直至血流被阻斷，靜脈局部變白。激光干預(yù)后，行FFA檢查確定靜脈阻塞形成。激光擊破血管造成玻璃體混濁明顯、影響眼底觀察者、激光誤傷伴行動(dòng)脈者，排除在本實(shí)驗(yàn)研究范圍以外。

1.2.3 給藥方法：造模后1 h開始給藥，空白對(duì)照組用生理鹽水灌胃，2次/d，5 ml/次；中藥各組分別用不同湯藥灌胃，2次/d，5 ml/次，連續(xù)給藥 28 d。

1.2.4 觀察內(nèi)容：（1）FFA檢查：觀察視網(wǎng)膜熒光素滲漏、靜脈阻塞情況。（2）血漿抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）及纖溶酶原（PLG）水平測(cè)定：耳緣靜脈采血1.8 ml，注入0.2ml枸櫞酸鈉管，即刻混勻，3000r/min離心10min，取上清于-40℃保存待檢。采用發(fā)色底物法測(cè)定ATⅢ和纖溶酶原水平。（3）視網(wǎng)膜組織TXB2、6-Keto-PGF1α水平測(cè)定：摘除眼球僅留全部視網(wǎng)膜，立即用無菌冷PBS緩沖液漂洗去表面色素及出血，稱重后剪碎，加入9倍重的冷生理鹽水，充分手動(dòng)勻漿。將勻漿液于4℃，3 500 r/min離心15 min，取上清于-80℃保存待檢。按TXB2、6-Keto-PGF1α放射免疫試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)均設(shè)立為雙側(cè)檢驗(yàn)P=0.05?？傮w均數(shù)的估計(jì)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；等級(jí)評(píng)分比較采用多樣本秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H Test），若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Mann-Whitney U Test兩兩比較。檢驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FFA視網(wǎng)膜靜脈血管情況（圖1-2）

靜脈光凝處收縮變細(xì)，血柱變窄以至消失，光凝靜脈呈臘腸樣節(jié)段狀閉鎖，毗鄰視網(wǎng)膜呈灰白色水腫或見散在出血，受阻靜脈直至終末小靜脈明顯迂曲擴(kuò)張，阻塞區(qū)供應(yīng)動(dòng)脈痙攣性收縮變細(xì)。

2.2 兔血清ATⅢ、PLG水平

2.2.1 各組ATⅢ水平變化：正常組ATⅢ值：79.54%±1.04%（±s）。 模型組：造模 30 min～1 d，ATⅢ水平高于正常組；3～14 d下降并維持在低于正常組水平；28 d緩慢回升接近正常組。止血組：30 min～3 d，ATⅢ水平低于模型組；3～7 d緩慢上升，并高于模型組；14 d逐漸回落至模型組水平；28 d ATⅢ水平緩慢回升但略低于模型組。活血組：造模30 min～1 d，ATⅢ水平與模型組接近；1～3 d持續(xù)上升，高于模型組；3～14 d逐漸回落但仍高于模型組水平；28 d ATⅢ水平持續(xù)低于模型組。止血+活血組：造模30 min～3 d，ATⅢ水平低于模型組；3～7 d 持續(xù)升高；7～14 d 逐漸回落但仍高于模型組；28 d ATⅢ水平低于模型組。各組ATⅢ水平變化見圖3。

2.2.2 不同時(shí)間段用藥各組與模型組ATⅢ水平比較：造模30 min～1 d，止血組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模3 d，模型組與活血組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），止血組與活血、止血+活血組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；造模 7 d，模型組與止血+活血組、活血組與止血+活血組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；造模14～28 d，各組間兩兩比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2.3 各組PLG變化規(guī)律：正常組PLG值：76.42%±1.37%（±s）。 模型組：造模 30 min～1 d，PLG 水平高于正常組；3～14 d下降并維持低于正常組；28 d緩慢回升至正常組水平。止血組：造模30 min～1 d，PLG水平與模型組接近；3 d明顯下降低于模型組；7～28 d迅速回升并持續(xù)高于模型組?；钛M：造模30 min～1 d，PLG水平緩慢升高，并持續(xù)高于模型組；3～7 d仍高于模型組但開始下降；14～28 d下降并保持在模型組以下。止血+活血組：造模30 min，PLG水平接近模型組；1～28 d走勢(shì)與模型組類似但始終略高于模型組（圖 4）。

2.2.4 不同時(shí)間段用藥各組與模型組PLG水平比較：造模30 min，PLG水平各組間均無差異；造模1 d，活血組與模型組、止血組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模3 d，模型組與止血組、活血組，止血組、活血組、止血+活血組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；造模7 d，止血組與模型組、止血+活血組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；造模 14 d～28 d，活血組與止血組、止血＋活血組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 兔視網(wǎng)膜勻漿TXB2、6-Keto-PGF1α水平

2.3.1 各組TXB2變化規(guī)律：正常組TXB2值：9.82±0.77（pg/mg，±s）。 模型組：與正常組相比，造模 3 d，TXB2水平低于正常組，后持續(xù)升高；造模14 d接近正常組；14～28 d持續(xù)升高，高于正常組。止血組：造模3 d TXB2水平高于模型組；3～14 d保持平穩(wěn)；14～28 d接近模型組，持續(xù)升高?；钛M：造模3～28 d TXB2水平持續(xù)升高；均高于模型組。止血＋活血組：造模3～14 d TXB2水平接近模型組，持續(xù)升高；14～28 d繼續(xù)升高，高于模型組。

2.3.2 各組6-Keto-PGF1α變化規(guī)律：正常組6-Keto-PGF1α值：10.27±0.74（pg/mg，±s）。 模型組：與正常組相比，造模3 d時(shí)6-Keto-PGF1α接近正常組，后持續(xù)升高。 止血組：造模 3～14 d，6-Keto-PGF1α水平緩慢升高，高于模型組；14～28 d，仍升高但低于模型組。 活血組：造模 3～14 d，6-Keto-PGF1α水平緩慢升高，高于 A 組；14～28 d，仍升高，至 28 d 低于模型組。止血＋活血組：造模3 d，6-Keto-PGF1α水平高于模型組；3～14 d， 逐漸降至低于模型組；14～28 d，水平升高但仍低于模型組。

2.3.3 各組TXB2/6-Keto-PGF1α變化規(guī)律：正常組TXB2/6-Keto-PGF1α值：0.96±0.02（±s）。 模型組：與正常組相比，造模3 d時(shí)比值高于正常組，后持續(xù)下降，14 d以后低于正常組。止血組：造模3～14 d比值緩慢降低，低于模型組；14～28 d升高至接近正常組?；钛M：造模3 d比值低于模型組；3～14 d緩慢升高，高于模型組；14～28 d轉(zhuǎn)而下降至接近正常組。止血＋活血組：造模3 d比值明顯低于模型組；3～14 d升高，高于模型組；14～28 d比值降至接近正常組（圖5）。

2.4 不同時(shí)間段用藥各組與模型組TXB2/6-Keto-PGF1α 水平比較

造模3 d，模型組與止血＋活血組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其余各組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模14 d，活血組與止血組、止血＋活血組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模 28 d，模型組與止血組、活血組、止血＋活血組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（RVO）是由于視網(wǎng)膜中央靜脈的主干或分支發(fā)生阻塞所致的視網(wǎng)膜血液循環(huán)障礙〔1〕。當(dāng)發(fā)生RVO后，視網(wǎng)膜血液循環(huán)會(huì)出現(xiàn)急性的病理改變，早期血液回流發(fā)生障礙，管腔壓力增高，小血管及毛細(xì)血管破裂出血，繼之出血凝固并殘留于視網(wǎng)膜；微血管反應(yīng)性擴(kuò)張，毛細(xì)血管通透性增加，視網(wǎng)膜充血水腫加重；后期（1個(gè)月后）病情加重者其毛細(xì)血管閉塞形成無灌注區(qū)，組織缺血、缺氧加重〔2〕。在這一系列病理過程中其凝血機(jī)制和微循環(huán)調(diào)控發(fā)生變化，特別是凝血因子及微血管調(diào)節(jié)因子隨著時(shí)期不同發(fā)生相應(yīng)變化。

抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）是主要的血漿抗凝物質(zhì)，對(duì)凝血酶的滅活能力占所有抗凝蛋白的70%～80%，此外，ATⅢ還能抑制凝血因子Ⅹa、Ⅸa、Ⅺa、Ⅻa 以及纖溶酶、胰蛋白酶、激肽釋放酶等，已有研究報(bào)道〔3〕血漿中的抗凝血酶Ⅲ在血栓栓塞性疾病的形成和發(fā)展過程中起重要作用。纖溶酶原（PLG）是纖溶系統(tǒng)的最基本核心成分，存在于血液中，在活化素作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，其含量減少，表明纖溶活性增強(qiáng)；含量增加，則表明纖溶活性減弱，因此測(cè)量血漿中ATⅢ及PLG含量能夠了解機(jī)體凝血、抗凝及纖溶系統(tǒng)狀況〔4〕。其含量增高則起抗凝作用，含量降低則起促凝作用。

血栓素 A2（TXA2）、前列環(huán)素（PGⅠ2）以及血栓素/前列環(huán)素的比率（TX/PGⅠ）是影響血管舒縮的重要因素。Yamanobe 、Mizugaki等〔5，6〕研究認(rèn)為 RVO 的病變過程與 TXA2、PGⅠ2及其比率（TX/PGⅠ）增高有一定關(guān)系。血栓素與前列環(huán)素系花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，前者是最強(qiáng)的血小板致聚劑，有強(qiáng)烈的縮血管作用；后者有擴(kuò)張血管的作用，抑制血小板聚集。正常情況下二者處于動(dòng)態(tài)平衡，以維持正常血流狀態(tài)。TXA2升高，PGⅠ2下降，即比值升高，則導(dǎo)致血管痙攣、閉塞，加重缺血，反之則導(dǎo)致血管擴(kuò)張。而血栓素B2（TXB2）和6酮前列腺素 F1α（6-Keto-PGF1α） 是血栓素 A2（TXA2）和前列環(huán)素（PGⅠ2）的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物〔7〕。 故實(shí)驗(yàn)中選用TXB2/6-Keto-PGF1α比值作為檢測(cè)指標(biāo)。

RVO屬于中醫(yī)“血證”范疇，歷代醫(yī)家以《血證論》〔8〕“止血、消瘀、寧血、補(bǔ)虛”治血四法為理論基礎(chǔ)指導(dǎo)臨床治療，取得良好的效果，其中涼血止血法及活血通絡(luò)法在RVO治療中是最常用的治法，且常以兩法合用。血府逐瘀湯、十灰散是臨床治療RVO最為常見的基礎(chǔ)方。以往研究表明，血府逐瘀湯能夠促進(jìn)組織血管的血液循環(huán)，有舒張血管，增加血流量，降低血管阻力的功能；可調(diào)整凝血及抗凝血系統(tǒng)，防止血栓形成〔9〕。十灰散中的成分能不同程度地縮短出血和/或凝血時(shí)間；能增加體內(nèi)血小板促進(jìn)血凝〔10〕。從以往的經(jīng)驗(yàn)看，涼血止血法具有促凝作用，能夠激活凝血系統(tǒng)和血小板，降低毛細(xì)血管通透性，起到止血及減少水腫等作用；活血通絡(luò)化瘀法具有抗凝和舒張血管作用，能夠改善微循環(huán)，起到促進(jìn)出血、水腫吸收、增加視網(wǎng)膜供氧等作用。而兩法在治療過程中如何起作用，其分子生物學(xué)作用機(jī)制有何異同，并不十分清楚。

為了探討中醫(yī)藥對(duì)RVO病理過程中其凝血機(jī)制和微循環(huán)調(diào)控的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)從血清抗凝血因子ATⅢ、PLG及影響微血管舒縮狀態(tài)的TXB2/6-Keto-PGF1α比值途徑進(jìn)行初步的研究，以期能說明涼血止血法及活血通絡(luò)法在RVO治療作用中的異同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)RVO發(fā)生后凝血因子及微循環(huán)調(diào)控因子在不同時(shí)段會(huì)發(fā)生不同的改變。從動(dòng)物模型檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在凝血機(jī)制方面表現(xiàn)為病變?cè)缙冢?天內(nèi)）血清抗凝血因子ATⅢ、PLG較正常組升高，血液系統(tǒng)呈溶血狀態(tài)；3天后即開始下降，呈凝血狀態(tài)；28天后趨于正常。在微循環(huán)方面表現(xiàn)為病變?cè)缙冢? 天）TXB2/6-Keto-PGF1α比值升高，微血管呈收縮狀態(tài)，7天時(shí)接近正常，14天后比值降低，并一直保持較低水平，呈舒血管狀態(tài)。

中藥對(duì)凝血因子及微循環(huán)的影響呈雙向調(diào)節(jié)。在凝血機(jī)制方面：涼血止血法在RVO病變?cè)缙冢?天內(nèi)）能降低抗凝血因子ATⅢ、PLG，起促凝血作用，利于止血；7天以后（早期）則提高抗凝血因子ATⅢ、PLG水平，可減少血栓形成，14天后該作用減弱；活血通絡(luò)法在早中期具有抗凝作用，7天時(shí)最強(qiáng)，可減少血栓形成，14天以后作用減弱，后期（28天）有輕微促凝作用；兩法合用組則以抗凝作用為主。在調(diào)節(jié)血管平滑肌方面：三組藥物在RVO病變較早期（7天）均降低TXB2/6-Keto-PGF1α比值，微血管均呈舒張作用，可能有利于改善組織缺氧，相對(duì)而言，兩法合用組早期舒血管作用較強(qiáng)，涼血止血法早期舒血管作用較持久；中期以后（2～4周）比值提高，表現(xiàn)出收縮血管趨勢(shì)。

中醫(yī)藥的良性雙向調(diào)節(jié)作用一方面證明了中醫(yī)治療的安全性，另一方面我們?cè)谂R床應(yīng)用上應(yīng)根據(jù)疾病不同時(shí)段或不同疾病，針對(duì)不同的病理狀況進(jìn)行辨證施治，以提高療效。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，RVO發(fā)生早期（3天），血液系統(tǒng)呈溶血狀態(tài)，3天后血液系統(tǒng)開始向凝血狀態(tài)發(fā)展，因此，臨床上1周內(nèi)應(yīng)以涼血止血法治療為主，利于止血，而活血通絡(luò)法在早期有抗凝作用，應(yīng)慎用，以防再出血；發(fā)病1周至2周之間，血液系統(tǒng)呈凝血狀態(tài)，而這時(shí)兩類中藥的作用是向良性調(diào)節(jié)，涼血止血法和活血通絡(luò)法均起抗凝作用，故應(yīng)兩法合用，且兩法合用在這時(shí)舒張血管作用最大，可減少血栓形成。RVO發(fā)病2周至4周，血液系統(tǒng)凝血狀態(tài)趨于正常，但微血管開始擴(kuò)張，通透性增加，易造成視網(wǎng)膜水腫、充血，治宜收縮血管，而這時(shí)兩類中藥均有收縮血管的作用，同樣應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用。針對(duì)RVO的治療，早期應(yīng)考慮凝血狀態(tài)為主，后期則應(yīng)考慮改善微循環(huán)為要。對(duì)于4周以后，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管閉塞形成無灌注區(qū)，組織缺血及新生血管增生，這時(shí)中醫(yī)對(duì)改善凝血及微循環(huán)的作用機(jī)制如何以及對(duì)新生血管增生是否有調(diào)控作用，由于本實(shí)驗(yàn)尚未涉及，尚無分析結(jié)果。中藥在凝血方面及微循環(huán)調(diào)節(jié)方面的作用特別是它的雙向調(diào)節(jié)功能比較復(fù)雜，仍然有待于進(jìn)一步的深入研究。

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