EPO對AD樣大鼠海馬組織氧化應激反應的影響

靳 力，李宜培，王 黎△

(1.鄭州大學基礎醫(yī)學院，鄭州450052;2.河南衛(wèi)生職工學院，鄭州451191)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與衰老相關的神經(jīng)退行性疾病，其組織病理學特征表現(xiàn)是老年斑的沉積，神經(jīng)纖維的纏結，神經(jīng)元和突觸的丟失［1］。其中淀粉樣蛋白-β 是老年斑的主要成分，并且在阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色，盡管Aβ 引起AD 發(fā)病的確切機制仍不清楚，但許多證據(jù)提示由Aβ 激起的過強的氧化應激反應是AD 一個重要的致病因素［2-3］。此外，在Aβ 誘導的神經(jīng)退行性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，過多活性氧自由基的產(chǎn)生能夠?qū)е律窠?jīng)元細胞的凋亡［4-5］。所以，抗氧化治療是AD 病治療的重要策略之一。

EPO 是一種調(diào)控紅細胞生成的糖蛋白，臨床上被廣泛的引用于治療各種貧血癥狀。近年來發(fā)現(xiàn)，EPO 在多種腦損傷和神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用［6-10］。并且，相關研究發(fā)現(xiàn)EPO 具有對抗氧化應激的功能［11-12］。因此，本實驗應用Aβ1-42復制AD 大鼠模型，觀察EPO 對AD 大鼠海馬總抗氧化能力、過氧化氫酶、一氧化氮、一氧化氮合成酶含量的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD 大鼠40 只，清潔級，體質(zhì)量220 ～250 g，動物批號:SCXK(豫)2010 ～0002，由河南省實驗動物中心提供。經(jīng)Y 迷宮篩選淘汰4 只后，其余隨機分為3組:生理鹽水組，AD 模型組和EPO 治療組，每組12 只。自由飲食，晝夜節(jié)律，室溫保持在20 ℃。

1.2 主要試劑和儀器 總抗氧化能力測試盒，過氧化氫酶測試盒，一氧化氮測試盒，一氧化氮合成酶測試盒以上試劑均購自南京建成生物工程研究所;可見光分光光度計(北京普系統(tǒng)用儀器責任有限公司);組織勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司);超速冷凍離心機(德國backman 公司)。

1.3 Aβ1-42孵育及模型制作 將Aβ1-42溶于無菌生理鹽水中，稀釋成10 ug/ul 的濃度，置于37 ℃恒溫箱孵育一周，使其變?yōu)榫酆蠎B(tài)。用6%水合氯醛(30 mg/kg)對大鼠進行腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠頭頂部備皮并固定于腦立體定位儀上，以前囟為定位原點，參照《大鼠腦立體定位圖譜》定位大鼠海馬CA1 區(qū):前囟后4.0 mm，中線旁2.0 mm，顱骨下進針3.6 mm。用微量進樣器對每只大鼠雙側海馬進行Aβ1-42注射:每只每側注射1 ul，注射10 min，留針10 min，以確保溶液充分彌散，隨后緩慢撤針，骨蠟封堵針孔，縫合消毒皮膚，術后每只肌注10 萬單位青霉素預防感染。

AD 模型組和EPO 治療組大鼠海馬注射Aβ1-42，生理鹽水組大鼠海馬注射等量生理鹽水。EPO組從造模當天起腹腔注射rHu -EPO，劑量為5 000 IU/kg，隔天一次，共5 次。

2 檢測方法

2.1 測試樣品的制備 取海馬置于4 ℃的生理鹽水中漂洗，去除血液，濾紙拭干，稱重，按重量∶體積=1∶9 的比例加入4 ℃的生理鹽水，用組織勻漿器充分勻漿，將勻漿液以2 500 轉/分，離心10 ～15 min，取上清液，并用用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。取已處理好的待測樣品上清液于4 ℃冰箱解凍，濃度為10%。嚴格按照實驗操作表進行工作液的配制和對樣品的檢測。測定海馬組織總抗氧化能力及過氧化氫酶、一氧化氮、一氧化氮合成酶的含量。

2.2 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，應用SPSS19.0 軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計學處理，組間比較用t檢驗，a=0.05 作為檢驗標準。

3 結果

3.1 各組大鼠海馬勻漿總抗氧化能力的變化 結果如圖1 所示:與生理鹽水組相比較，AD 模型組的總抗氧化能力明顯地下降(P ＜0.05)，而EPO 治療組與AD 模型組相比總抗氧化能力顯著地升高(P ＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學的意義。

表1 各組大鼠T-AOC 能力，CAT 活力，NO 含量和NOS 活性的變化(n=12)

3.2 各組大鼠過氧化氫酶活性的變化 結果如圖2 所示:與生理鹽水組相比較，AD 模型組的過氧化氫酶活性明顯地下降(P ＜0.05)，同時，EPO 治療組與AD 模型組相比，過氧化氫酶活性顯著地升高(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。

3.3 各組大鼠一氧化氮含量的變化 結果如圖3所示:與生理鹽水組和EPO 治療組相比，AD 模型組的一氧化氮含量明顯地升高(P ＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 各組大鼠總抗氧化能力的變化與生理鹽水組和EPO治療組相比，AD模型組T-AOC明顯下降（P＜0.05）

圖2 各組大鼠過氧化氫酶活性的變化與生理鹽水組和EPO治療組相比，AD模型組的CAT活性明顯下降（P＜0.05）

圖3 各組大鼠NO含量的變化與生理鹽水組和EPO治療組相比，AD模型組的NO含量明顯地升高（P＜0.05）

3.4 各組大鼠一氧化氮合成酶活性的變化 結果如圖4 所示:與生理鹽水組相比，AD 模型組的一氧化氮合成酶活性明顯地升高(P ＜0.05)，同時，EPO治療組與AD 模型組相比，一氧化氮合成酶的活性顯著地下降(P ＜0.05)差異具有統(tǒng)計學意義。

圖4 各組大鼠NOS 活性的變化與生理鹽水組和EPO 治療組相比，AD 模型組的NOS 活性明顯地升高(P ＜0.05)

4 討論

許多研究認為氧化應激反應在阿爾茨海默病的發(fā)病過程中扮演了重要的角色［13-15］。首先，氧化應激反應可以誘導Aβ 的產(chǎn)生和聚集［16-17］，氧自由基的產(chǎn)生可以引起Aβ 前體蛋白表達的增高［18］，并增加神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生內(nèi)Aβ 的分泌［19］。此外，氧化應激反應還能增高早老素1［20］和Aβ 分泌酶［21］的表達。另一方面，Aβ 沉積也能夠引起氧化應激反應和損傷［21-22］，Aβ 通過過渡金屬離子(如Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e3+)來刺激活性氧自由基的產(chǎn)生［23］。Aβ 沉積可以引起神經(jīng)元細胞膜脂質(zhì)的過氧化，導致膜功能受損，引發(fā)Ca2+內(nèi)流，造成細胞內(nèi)Ca2+超載，損傷細胞器，從而引起細胞毒性反應和神經(jīng)元細胞的凋亡［24］。同時，Aβ 沉積所誘導的氧化應激反應還能夠線粒體DNA 的突變，引起氧化呼吸鏈功能受損，使線粒體功能的紊亂，阻礙細胞的能量代謝通路，從而產(chǎn)生更多的活性氧自由基，造成細胞的損傷［25］。另外，Aβ 的聚集可以損傷機體內(nèi)多種抗氧化酶的功能，引起機體抗氧化能力下降，加重氧化應激反應造成的損傷。

該實驗通過大鼠海馬區(qū)注射Aβ1-42制作AD 動物模型，并應用EPO 進行治療，通過檢測海馬組織的總抗氧化能力(T—AOC)和過氧化氫酶(CAT)活性，來觀察EPO 對AD 樣大鼠海馬組織抗氧化能力的影響。結果顯示，AD 模型組與生理鹽水組相比，T—AOC 和CAT 活性明顯降低，說明Aβ 削弱了AD模型組大鼠多種抗氧化酶的活力，造成了AD 模型組大鼠抗氧化能力的下降。而EPO 治療組與AD模型組相比，T—AOC 和CAT 活性顯著地升高而NO 含量和NOS 活性下降，說明EPO 增強了機體內(nèi)多種抗氧化酶的活力，從而有效地提高了機體總體的抗氧化能力，減輕了氧化應激反應對細胞的傷害，保護了神經(jīng)元細胞。

［1］Selkoe D J. Alzheimer’s disease:Genes，proteins，and therapy［J］. PHYSIOLOGICAL REVIEWS，2001，81(2).

［2］Barkats M，Abrioux P，Mallet J. Overexpression of glutathione peroxidase increases the resistance of neuronal cells to Abeta-mediated neurotoxicity.［J］. Journal of neurochemistry，2000，75(4):1 438 -1 446.

［3］Boldogh I，Kruzel M L. Colostrinin (TM):An oxidative stress modulator for prevention and treatment of age - related disorders［J］. Journal of alzheimers disease，2008，13(3).

［4］Moon J H，Kim S Y，Lee H G，et al. Activation of nicotinic acetylcholine receptor prevents the production of reactive oxygen species in fibrillar beta amyloid peptide (1 -42)-stimulated microglia［J］. Experimental and molecular medigine，2008，40(1):11-18.

［5］Sultana R，Mohmmad - Abdul H，Butterfield D A. Protective effect of the xanthate，D609，on Alzheimer’s amyloid beta-peptide (1 -42)-induced oxidative stress in primary neuronal cells［J］. Free radical research，2004，38(5):449 -458.

［6］Fisher J W. Erythropoietin:Physiology and pharmacology update［J］. Experimental biology and medicine，2003，228(1).

［7］Gonzalez F F，Mu D，Wendland M，et al. Erythropoietin enhances long-term neuroprotection and neurogenesis in neonatal stroke［J］. Developmental neuroscience，2007，29(4 - 5):321-330.

［8］Grasso G，Sfacteria A，Meli F，et al. Neuroprotection by erythropoietin administration after experimental traumatic brain injury［J］. Brain research，2007:99 -105.

［9］Lykissas M G，Vekris M D，Sakellariou E. The role of erythropoietin in central and peripheral nerve injury［J］. Clinical neurology and neurosurgery，2007，109(8):639 -644.

［10］Wu Y，Sun S，Yang W. Protective effect of erythropoietin against 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced neurodegenaration in PC12 cells.［J］. Neuroscience bulletin，2007，23(3):156 -164.

［11］Cetin H，Oktem F，Uz E，et al. Novel evidence suggesting an anti-oxidant property for erythropoietin on vancomycin - induced nephrotoxicity in a rat model［J］. Clinical and experimental pharmacology and physiology，2007，34(11):1 181 -1 185.

［12］Katavetin P，Eiam-Ong S. Antioxidative effects of erythropoietin.［J］. 2007(107).

［13］Markesbery W R. Oxidative stress hypothesis in Alzheimer＇s disease.［J］. Free radical biology ＆ medicine，1997，23(1):134-147.

［14］Pratico D. Oxidative injury in diseases of the central nervous system:focus on Alzheimer＇s disease.［J］. The American journal of medicine，2000，109(7):577 -585.

［15］Behl C. Alzheimer’s disease and oxidative stress:implications for novel therapeutic approaches. ［J］. Progress in neurobiology，1999，57(3):301 -323.

［16］Tabner B J，Turnbull S，Paleologou K E，et al. Hydrogen peroxide is generated during the very early stages of aggregation of the amyloid peptides implicated in Alzheimer disease and familial British dementia［J］. Journal of biological chemistry，2005，280(43):35 789 -35 792.

［17］Murakami K，Ohigashi H，Nagao M，et al. Formation and stabilization model of the 42 -mer A beta radical:Implications for the long-lasting oxidative stress in Alzheimer＇s disease［J］. Journal of the american chemical society，2005，127(43):15 168 -15 174.

［18］Patil S，Masserang A. Palmitic acid-treated astrocytes induce BACE1 upregulation and accumulation of C-terminal fragment of APP in primary cortical neurons［J］. Neuroscience letters，2006，406(1 -2):55 -59.

［19］Murray I，Komatsu H，Xiao G，et al. Membrane-mediated amyloidogenesis and the promotion of oxidative lipid damage by amyloid beta proteins［J］. Journal of biological chemistry，2007，282(13):9 335 -9 345.

［20］Tamagno E，Guglielmotto M，Aragno M，et al. Oxidative stress activates a positive feedback between the gamma-and beta-secretase cleavages of the beta-amyloid precursor protein［J］. Journal of neurochemistry，2008，104(3):683 -695.

［21］Tong Y，F(xiàn)ung V，Qing H，et al. Oxidative stress potentiates BACE1 gene expression and A beta generation［J］. Journal of neural transmission，2005，112(3):455 -469.

［22］Tamagno E，Obbili A，Borghi R，et al. Oxidative stress increases expression and activity of BACE in NT2 neurons［J］. Neurobiology of disease，2002，10(3):279 -288.

［23］Huang X，Atwood C S，Tyndall J D，et al. Cu(II)potentiation of alzheimer abeta neurotoxicity. Correlation with cell-free hydrogen peroxide production and metal reduction.［J］. The Journal of biological chemistry，1999，274(52):37 111 -37 116.

［24］Bezprozvanny I，Mattson M P. Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimer＇s disease［J］. Trends in neurosciences，2008，31(9):454 -463.

［25］Wang J，Xie C，Lovell M A. Increased oxidative damage in nuclear and mitochondrial DNA in Alzheimer＇s disease［J］. Journal of neurochemistry，2005，93(4):953 -962.