RP－HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地花生殼中二氫槲皮素的含量

李俊雅，李 君

(湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭411102)

花生殼是豆科蝶形花亞科、落花生屬、落花生果實(shí)成熟果殼，其中二氫槲皮素作為一種重要的黃酮類化合物存在于花生殼中?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究實(shí)驗(yàn)證明，二氫槲皮素具有抗氧化［1-2］、抗腫瘤、降膽固醇、改善腦部血液微循環(huán)等作用［3］，是花生殼中指標(biāo)性成分之一。該文以花生殼中的二氫槲皮素含量變化為依據(jù)，用RP-HPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地生殼中二氫槲皮素的含量，為花生殼作為藥材研究和評(píng)價(jià)提供一定的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(LC-20AT，日本島津公司)，紫外檢測(cè)器(SPD -20A，日本島津公司)，N2000 色譜工作站(浙江大學(xué)信息智能研究所)，超聲波清洗器(HS6150D，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)，溶劑過(guò)濾器(HL，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)，無(wú)油真空泵(HP -01，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)，電子天平(BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試劑 二氫槲皮素(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111640 -200604)，甲醇、異丙醇、乙腈為色譜純(天津四友天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)，所用其他試劑均為分析純，雙蒸水自制。

1.3 材料 花生殼樣品在國(guó)內(nèi)4個(gè)省區(qū)收集，共14 份(見(jiàn)表2)，經(jīng)專家鑒定，樣品均為豆科植物落花生的干燥成熟果殼。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取二氫槲皮素對(duì)照品5.15 mg，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含量0.206 mg 的溶液，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 菲羅門ODS(250 mm ×4.6 mm，4 μm);流動(dòng)相為甲醇:1%醋酸水溶液=40:60;流速1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm;柱溫25 ℃。

2.4 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜，測(cè)定，即得，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 二氫槲皮素對(duì)照品色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別從0.020 6 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取5、10、15、20、25 μL，依次進(jìn)行測(cè)定。以峰面積(x)為橫坐標(biāo)，以二氫槲皮素的進(jìn)樣量(y)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y =7.128 944x+0.139 064 1，R= 0.999 9，表明二氫槲皮素在4.75 ～23.75 μg 之間線性關(guān)系良好。

圖2 樣品色譜圖

圖3 二氫槲皮素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6 穩(wěn)定性考察 取同一花生殼試品溶液，分別在0、1、6、9、12、24 h 依次注入高效液相進(jìn)行分析，并計(jì)算其RSD(%)值。測(cè)得樣品的RSD 值為1.13%，表明樣品的穩(wěn)定性良好。

2.7 精密度考察 取同一花生殼供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，以峰面積計(jì)算RSD 值，得對(duì)照品溶液的RSD 為1.22%，表明精密度良好。

2.8 重現(xiàn)性考察 平行稱取5 份花生殼粉末各0.1 g，按2. 2 項(xiàng)下方法制備，進(jìn)行HPLC 分析，計(jì)算RSD 值，測(cè)得供試品RSD 值為1.49%，表明樣品的重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率考察 精密稱取花生殼干燥粉末5 份，分別加入一定量的二氫槲皮素對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法制備，進(jìn)高效液相進(jìn)行分析，并計(jì)算其RSD(%)值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 不同產(chǎn)地花生殼中二氫槲皮素的含量測(cè)定各地所產(chǎn)花生殼藥材樣品，按照上述方法制備供試品液，測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地花生殼中二氫槲皮素的含量測(cè)定結(jié)果

①河南、湖北、湖南、貴州四省產(chǎn)地中，以河南省許昌產(chǎn)地的花生殼中二氫槲皮素的含量最高(0.71%);貴州省凱里產(chǎn)地的最低(0.31%);②在選定色譜條件下二氫槲皮素在4.75 ～23.75 μg 之間線性關(guān)系良好，樣品加樣回收率為99.2%，RSD為1.69%(n=5)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同產(chǎn)地花生殼中二氫槲皮素含量有較為明顯的差別，其中黃淮流域花生殼中二氫槲皮素的含量較高，可能是因?yàn)椴煌漠a(chǎn)地，落花生生長(zhǎng)環(huán)境的土壤、水分、溫度等條件不同的所致;另外，可能與落花生不同品種有關(guān)。具體原因有待進(jìn)一步研究。

該文所建立花生殼中二氫槲皮素含量反相高效液相色譜方法操作簡(jiǎn)單，精密度和準(zhǔn)確度高，分離效果好，可以滿足對(duì)二氫槲皮素定量分析的要求，適用于相關(guān)中藥材中二氫槲皮素含量的測(cè)定。

［1］楊國(guó)峰，周建新，汪海峰等. 花生殼提取物的制備及其抗氧化與抗菌活性的研究進(jìn)展［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33 (2):97 -101.

［2］張 斌，孫蘭萍，馬龍等.花生殼提取物的體外抗氧化活性研究［J］.資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng)，2009，25 (7):586 -589.

［3］張芳芳，沈漢明，朱心強(qiáng).二氫槲皮素抗腫瘤作用的研究進(jìn)展［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，醫(yī)學(xué)版，2006，35 (5):573 -577.