流加不同物質(zhì)對(duì)大腸桿菌DB15(pAET-8)表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的影響＊

張艷軍，李志敏，葉 勤

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)是含有53 個(gè)氨基酸的小分子多肽，具有刺激蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、激活胞外大分子合成和促細(xì)胞增殖等作用，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］.因此，甘人寶課題組［2］構(gòu)建了pAET-8 質(zhì)粒，人表皮生長(zhǎng)因子基因在phoA 啟動(dòng)子控制下表達(dá).文獻(xiàn)［3］通過(guò)優(yōu)化表達(dá)期pH 和葡萄糖流加策略，使得大腸桿菌DA19(pAET-8)在基本培養(yǎng)基中表達(dá)hEGF 水平由8 mg·L-1提高到了78.7 mg·L-1.文獻(xiàn)［4］在此基礎(chǔ)上通過(guò)優(yōu)化氯化鈣的添加量和添加時(shí)間進(jìn)一步提高了hEGF 在基本培養(yǎng)基中的表達(dá)水平，最高達(dá)到了228 mg·L-1.

phoA 表達(dá)系統(tǒng)不僅具有分泌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，而且是一種經(jīng)濟(jì)的表達(dá)系統(tǒng)，只需限制培養(yǎng)基中磷的濃度即可.作為細(xì)胞生長(zhǎng)的必需元素，限制表達(dá)階段磷元素的濃度必然會(huì)影響細(xì)胞的生理和代謝.例如，在大腸桿菌DB15(pAET-8)表達(dá)hEGF 過(guò)程中，hEGF 生產(chǎn)速率在表達(dá)階段初期最大，表達(dá)階段后期活菌數(shù)明顯降低［4］，以活菌數(shù)為基準(zhǔn)的hEGF 比生產(chǎn)速率也有所降低，以菌體干質(zhì)量為基準(zhǔn)的hEGF 比生產(chǎn)速率降低更加明顯，同時(shí)還伴隨著乙酸生成速率的提高.因此，本研究考察了表達(dá)階段流加不同物質(zhì)——磷酸鹽、蛋白胨(tryptone)及酵母抽提物等對(duì)大腸桿菌DB15(pAET-8)表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的影響.

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌DB15 為華東理工大學(xué)葉勤實(shí)驗(yàn)室篩選得到的耐乙酸突變株［5］.質(zhì)粒pAET-8 由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞與生物化學(xué)研究所甘人寶課題組［2］構(gòu)建.基因工程菌DB15(pAET-8)由葉勤實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，并保存于-20 ℃的25%甘油溶液中.

1.2 培養(yǎng)基

所有培養(yǎng)基均使用去離子水配置.

1)LB 培養(yǎng)基 1 L 含蛋白胨(英國(guó)Oxoid 公司)10 g，酵母抽提物(Oxoid 公司)5 g，NaCl 10 g，pH 7.2.

2)M 培 養(yǎng) 基 1 L 含Na2HPO4·12H2O 15.12 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.011 g，葡萄糖6 g，氯化銨1 g，10 g·L-1維生素B1溶液0.2 mL，微量元素混合液［6］0.2 mL，pH 7.0.

3)MP 培養(yǎng)基 為磷限制的M 培養(yǎng)基，1 L 中含Na2HPO4·12H2O 1.89 g，KH2PO40.375 g，其他成分與M 培養(yǎng)基相同.

4)補(bǔ)料培養(yǎng)基 1 L 中含葡萄糖400 g，MgSO4·7H2O 10 g.

1.3 培養(yǎng)方法及條件

1.3.1 種子培養(yǎng)

將1 mL 冷凍保存的菌種DB15(pAET-8)接入裝有30 mL LB 培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶里，37 ℃，250 r·min-1搖床培養(yǎng)11 h.轉(zhuǎn)接1 mL 一級(jí)種子液于裝有70 mL M 培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，相同條件下培養(yǎng)9 h，作為表達(dá)hEGF 培養(yǎng)的二級(jí)種子.

1.3.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵罐裝入2.36 L MP 培養(yǎng)基，接入140 mL二級(jí)種子液.培養(yǎng)條件:攪拌轉(zhuǎn)速為 400 r·min-1，通氣量為4 L·min-1，溫度為37 ℃.通氣量和攪拌速率根據(jù)溶解氧(DO)進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整，以保證整個(gè)培養(yǎng)的過(guò)程中溶解氧在20%以上.用14%氨水控制培養(yǎng)基的pH 值，生長(zhǎng)期控制為7.0，表達(dá)期控制為7.8.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中及時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中銨離子濃度，當(dāng)其缺乏時(shí)手動(dòng)補(bǔ)加100 g·L-1的氯化銨培養(yǎng)基.

1.4 分析方法

菌體濃度測(cè)定采用濁度法，將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后測(cè)A600，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌體干質(zhì)量.葡萄糖含量采用葡萄糖測(cè)定試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所)測(cè)定.銨離子濃度采用Berthelot 法［7］比色測(cè)定.磷酸鹽采用磷鉬藍(lán)法［8］測(cè)定.乙酸測(cè)定采用氣相色譜法，儀器型號(hào)為GC112A(上海分析儀器廠)，以Chromosorb101 作為固定相.人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)測(cè)定采用Schagger 等改進(jìn)的分離小分子肽的tricine-tris 系統(tǒng)［9］分離，考馬斯亮藍(lán)染色，用圖像分析系統(tǒng)(復(fù)日生物電泳圖像分析系統(tǒng)，上海)和分析軟件(Smart View 分析軟件)進(jìn)行掃描定量.

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌DB15(pAET-8)表達(dá)hEGF 培養(yǎng)過(guò)程

大腸桿菌DB15(pAET-8)表達(dá)hEGF 的培養(yǎng)過(guò)程［4］分為3 個(gè)時(shí)期(見(jiàn)圖1):Ⅰ期為分批培養(yǎng)階段，即從發(fā)酵開(kāi)始到初糖耗完，以溶解氧跳升為結(jié)束標(biāo)志;Ⅱ期為指數(shù)生長(zhǎng)期，即初始葡萄糖耗盡后按照指數(shù)流加方式流加葡萄糖，控制菌體比生長(zhǎng)速率在0.26 h-1，直到菌體質(zhì)量濃度達(dá)到10.2 g·L-1，此時(shí)培養(yǎng)基中的磷含量已降低至足以誘導(dǎo)hEGF 的表達(dá);Ⅲ期為表達(dá)期，添加0.22 g·L-1氯化鈣，并以恒速方式(補(bǔ)糖速率為6.61 g·h-1)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，直到發(fā)酵結(jié)束.該補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程記為FB-1，菌體質(zhì)量濃度、乙酸含量、磷質(zhì)量濃度、菌體含磷量和葡萄糖比消耗速率(Qs)和hEGF 產(chǎn)量的變化趨勢(shì)如圖1 所示.

圖1 大腸桿菌DB15(pAET-8) 表達(dá)hEGF 的培養(yǎng)過(guò)程(FB-1)

在分批培養(yǎng)階段(Ⅰ期)，大腸桿菌DB15(pAET-8)以0.47 h-1的最大比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)，6.88 h時(shí)初始葡萄糖耗盡，溶解氧跳升，此時(shí)乙酸含量為0.17 g·L-1.在Ⅱ期前期，殘余葡萄糖含量一直為零，且無(wú)乙酸產(chǎn)生;但在Ⅱ期接近尾聲時(shí)，磷元素已成為菌體生長(zhǎng)的限制元素，造成乙酸積累，使得Ⅱ期結(jié)束時(shí)乙酸的質(zhì)量濃度達(dá)到0.26 g·L-1.在表達(dá)階段(Ⅲ期)，無(wú)機(jī)磷(Pi)的質(zhì)量濃度維持在2 mg·L-1左右，但13.14～21.63 h時(shí)菌體質(zhì)量濃度仍有明顯的增加，由10.6 g·L-1增加至13.1 g·L-1.由于補(bǔ)料培養(yǎng)基中并不含有無(wú)機(jī)磷，因而，此階段菌體質(zhì)量濃度的增加是以降低菌體含磷量為代價(jià)的，其由32.3 mg·g-1降低至26.0 mg·g-1(見(jiàn)圖1).此階段hEGF 合成速率為12.1 mg·L-1·h-1，且沒(méi)有乙酸積累.24.2 h后菌體質(zhì)量濃度無(wú)明顯增加，hEGF 的生產(chǎn)速率降低至8.9 mg·L-1·h-1，且乙酸生成速率增加.至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，hEGF 和乙酸的質(zhì)量濃度分別為207 mg·L-1和0.77 g·L-1.

2.2 表達(dá)階段流加不同物質(zhì)對(duì)hEGF 表達(dá)的影響

磷元素是微生物細(xì)胞中許多含磷細(xì)胞成分，如核酸、核蛋白、磷脂、三磷酸腺苷(ATP)、輔酶的重要組成元素，在遺傳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、能量供應(yīng)等方面都是不可缺少的.在大腸桿菌DB15(pAET-8)表達(dá)hEGF 階段，磷元素含量一直處于限制狀態(tài)，這必然會(huì)對(duì)菌體生理代謝及hEGF 表達(dá)造成影響.因此，筆者考察了表達(dá)階段流加不同物質(zhì)——磷酸鹽、蛋白胨和酵母抽提物等對(duì)大腸桿菌DB15 (pAET-8)表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的影響.

2.2.1 磷酸鹽

表達(dá)階段后期菌體質(zhì)量濃度不再增加時(shí)，hEGF 生產(chǎn)速率明顯降低.因此，在表達(dá)階段限制性流加磷酸鹽，以維持菌體的生長(zhǎng)，但保持培養(yǎng)液的磷限制，考察了其對(duì)hEGF 表達(dá)的影響.

培養(yǎng)條件與FB-1 相同.表達(dá)階段以8.49 g·h-1恒速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)以12 mg·h-1的流速流加無(wú)機(jī)磷，記為FB-2.整個(gè)過(guò)程各指標(biāo)的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2，并與FB-1 過(guò)程進(jìn)行比較.

在野生型大腸桿菌中，phoA 編碼的堿性磷酸酯酶的合成在磷過(guò)量培養(yǎng)基中被阻遏，而在磷限制培養(yǎng)基中被去阻遏.phoA 啟動(dòng)子的誘導(dǎo)與胞內(nèi)磷含量無(wú)關(guān)，而由胞外無(wú)機(jī)磷的含量控制［10］.雖然在表達(dá)階段流加了磷酸鹽，但培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)磷含量及表達(dá)階段初期菌體含磷量等均與對(duì)照FB-1接近(見(jiàn)圖2(b)).因此，流加磷酸鹽并未影響phoA 表達(dá)系統(tǒng)啟動(dòng)表達(dá)hEGF.此外，在表達(dá)階段恒速流加磷酸鹽，不但增加了表達(dá)初期菌體的比生長(zhǎng)速率，而且延長(zhǎng)了菌體生長(zhǎng)期，使得菌體質(zhì)量濃度在27 h 后仍有明顯的增加(見(jiàn)圖2(a)).與FB-1 相比，表達(dá)期流加磷酸鹽使得最終菌體質(zhì)量濃度提高了31%.盡管葡萄糖比供應(yīng)速率較對(duì)照提高了0.027 g·g-1·h-1，但hEGF 的表達(dá)量比對(duì)照FB-1 減少了57%，僅為90 mg·L-1.因此，在表達(dá)階段僅僅補(bǔ)加磷酸鹽對(duì)hEGF 的表達(dá)不但無(wú)益，反而有害.此外，在表達(dá)階段后期流加磷酸鹽也未能改善hEGF 的表達(dá).

圖2 表達(dá)階段流加磷酸鹽對(duì)hEGF 生產(chǎn)的影響(FB-2)

2.2.2 蛋白胨

蛋白胨中含有少量無(wú)機(jī)磷，而且在滅菌過(guò)程中部分有機(jī)磷會(huì)轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷;同時(shí)，蛋白胨還含有各種氨基酸，可以為蛋白翻譯提供前體.因此，在表達(dá)期間流加蛋白胨，考察了其對(duì)hEGF 表達(dá)的影響.

培養(yǎng)條件與FB-1 相同.表達(dá)階段以6.95 g·h-1恒速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基(在26 h 時(shí)提高至10.16 g·h-1)，同時(shí)以1.23 g·h-1的速度流加蛋白胨，記為FB-3.整個(gè)過(guò)程各指標(biāo)的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3.

滅菌后蛋白胨含有少量的磷酸鹽，但整個(gè)表達(dá)階段磷的質(zhì)量濃度維持在較低水平，菌體含磷量也與對(duì)照FB-1 接近，因此并未影響phoA 表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá).與對(duì)照FB-1 相比，流加蛋白胨延長(zhǎng)了菌體生長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)菌體質(zhì)量濃度提高了約23%.盡管在表達(dá)階段流加蛋白胨可以為hEGF 合成和菌體生長(zhǎng)提供各種氨基酸，但hEGF 表達(dá)水平和表達(dá)速率卻有所降低，hEGF比生產(chǎn)速率則降低得更多.表達(dá)階段后期乙酸含量略高于同期對(duì)照，與較高的葡萄糖比供應(yīng)速率有關(guān).

2.2.3 酵母抽提物

酵母抽提物不但含有無(wú)機(jī)磷和各種氨基酸，而且還含有核苷酸及微量元素，它在培養(yǎng)過(guò)程中起到非常重要的作用，如減少乙酸生成、增強(qiáng)培養(yǎng)基緩沖能力、促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)等［11］.因此，在表達(dá)期間流加酵母抽提物，考察了其對(duì)hEGF 表達(dá)的影響.

圖3 表達(dá)階段流加蛋白胨對(duì)hEGF 生產(chǎn)的影響(FB-3)

圖4 表達(dá)階段流加酵母抽提物對(duì)hEGF 生產(chǎn)的影響(FB-4)

培養(yǎng)條件與FB-1 相同.表達(dá)階段以6.57 g·h-1恒速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基(在26.56 h 時(shí)提高至8.82 g·h-1)，同時(shí)以1.32 g·h-1的流速流加酵母抽提物，記為FB-4，其過(guò)程曲線見(jiàn)圖4.

酵母抽提物滅菌后含有少量的磷酸鹽，與流加磷酸鹽和蛋白胨的培養(yǎng)過(guò)程類(lèi)似，流加酵母抽提物不但增加了表達(dá)階段初期菌體的比生長(zhǎng)速率，而且延長(zhǎng)了菌體生長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)使得培養(yǎng)結(jié)束時(shí)菌體質(zhì)量濃度提高了19%，但整個(gè)過(guò)程中磷酸鹽質(zhì)量濃度維持在較低水平，表達(dá)階段菌體含磷量也與對(duì)照FB-1 接近，因此并未影響phoA 表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá).培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，hEGF 表達(dá)水平達(dá)到250 mg·L-1，明顯高于在表達(dá)階段流加磷酸鹽時(shí)hEGF 的表達(dá)水平，這是因?yàn)榻湍赋樘嵛锟梢詾榫w生長(zhǎng)和合成hEGF 提供氨基酸和核苷酸，而在基本培養(yǎng)基中這些都需要由葡萄糖從頭合成.在表達(dá)階段前期，2 個(gè)過(guò)程的葡萄糖比供應(yīng)速率都在0.20 g·g-1·h-1左右，hEGF 的生產(chǎn)速率也基本一致，但FB-4 的菌體質(zhì)量濃度高于對(duì)照FB-1，而hEGF 的比生產(chǎn)速率低于FB-1.

對(duì)照FB-1 在24 h 左右即開(kāi)始有乙酸積累，而FB-4 培養(yǎng)過(guò)程中乙酸含量幾乎一直為零.活細(xì)胞計(jì)數(shù)表明:流加酵母抽提物使得表達(dá)期的活菌數(shù)降低較少，表明流加酵母抽提物減輕了表達(dá)hEGF 所引起的細(xì)胞代謝負(fù)荷，從而減少了乙酸的生成［11］;同時(shí)，表達(dá)階段后期hEGF 表達(dá)速率也未有明顯的降低.培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)入的氨水量也有所減少，這是因?yàn)榇竽c桿菌在利用復(fù)合氮源作為碳源時(shí)可以釋放出氨［11］，從而減少了控制pH所需的氨水.

FB-4 培養(yǎng)過(guò)程中幾乎沒(méi)有乙酸產(chǎn)生，表明葡萄糖可能不足，提高表達(dá)階段葡萄糖供給速率后hEGF 表達(dá)速率無(wú)明顯改善，反而造成了表達(dá)階段后期乙酸的積累(數(shù)據(jù)未列出).

3 討論與結(jié)論

phoA 表達(dá)系統(tǒng)不僅具有分泌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，而且是相對(duì)經(jīng)濟(jì)的表達(dá)系統(tǒng)之一，只需培養(yǎng)基中磷含量較低即可.但是作為細(xì)胞生長(zhǎng)的必需元素，磷限制會(huì)影響細(xì)胞的生理和代謝.在表達(dá)階段單獨(dú)流加磷酸鹽雖然增加了表達(dá)初期菌體的比生長(zhǎng)速率，延長(zhǎng)了菌體生長(zhǎng)期，提高了菌體質(zhì)量濃度，但是hEGF 產(chǎn)量卻比對(duì)照組減少了57%.大腸桿菌在基本培養(yǎng)基中表達(dá)hEGF 時(shí)需要從頭合成各種氨基酸，而過(guò)多的菌體生長(zhǎng)會(huì)消耗部分能量和氨基酸前體，由此推測(cè)氨基酸合成可能是hEGF表達(dá)的限速步驟.在表達(dá)階段流加蛋白胨不但可以補(bǔ)充無(wú)機(jī)磷，同時(shí)也可以為hEGF 合成和菌體生長(zhǎng)提供各種氨基酸，但hEGF 表達(dá)水平和表達(dá)速率卻有所降低.酵母抽提物不但含有無(wú)機(jī)磷和各種氨基酸，而且還含有核苷酸及微量元素，但是在表達(dá)階段流加酵母抽提物也未能提高h(yuǎn)EGF 表達(dá)水平.由此表明，氨基酸或核苷酸合成并不是hEGF 表達(dá)的限速步驟.

蛋白質(zhì)的合成是一個(gè)高能耗的過(guò)程，延伸的肽鏈每增加一個(gè)氨基酸需消耗1 個(gè)ATP 和3 個(gè)三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)［12］，是細(xì)胞內(nèi)最耗能的一個(gè)過(guò)程.此外，質(zhì)粒的復(fù)制也需要一定的能量，質(zhì)粒越大，拷貝數(shù)越多，所需的能量就越多［13］.因此，在過(guò)量表達(dá)外源蛋白的重組大腸桿菌中，能量供給往往受到限制［14］.在大腸桿菌DB15(pAET-8)表達(dá)hEGF 階段，磷元素一直處于限制狀態(tài)，而磷限制是非常強(qiáng)的解偶聯(lián)劑［15］.在磷限制條件下，葡萄糖運(yùn)輸、三羧酸循環(huán)(TCA 循環(huán))及呼吸鏈中的基因轉(zhuǎn)錄水平均被下調(diào)，而糖酵解途徑和還原型輔酶Ⅰ(NADH)脫氫酶基因則被上調(diào)［12］.大腸桿菌在磷限制條件下蛋白質(zhì)表達(dá)分析表明:sucC，sucB，gltA 和icdE 等編碼的TCA 循環(huán)中的酶，以及丙酮酸脫氫酶亞基(AceF)的表達(dá)水平降低了2～4 倍;而gnd 編碼的磷酸戊糖呼吸途徑(PP 途徑)中6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和pfkB 編碼的糖酵解途徑(EMP 途徑)中磷酸果糖激酶-2 單體的表達(dá)水平則分別增加了4.98 和3.89 倍［16］.此外，Bacillus subtilis 在不同營(yíng)養(yǎng)限制下的代謝流分布結(jié)果表明:與碳源或氮源限制相比，磷限制條件下的TCA 循環(huán)流量大大降低，而流向乙酸等溢流代謝物的流量則大大提高［17］.同時(shí)，大腸桿菌在磷限制條件下下調(diào)了TCA 循環(huán)和呼吸鏈活性［12］，從而減少了ATP 的形成.因此，提高大腸桿菌DB15(pAET-8)合成ATP 的能力或許是提高h(yuǎn)EGF 表達(dá)的關(guān)鍵.

此外，合成精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、天門(mén)冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺及纈氨酸途徑的基因轉(zhuǎn)錄水平在磷限制條件下被下調(diào)［15］，這在一定程度也會(huì)影響hEGF 在基本培養(yǎng)基中的表達(dá).

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