海藻酸鈣固定化At. ferrooxidans 的研究

張爽，陳志寶，晏磊，馬星辰，趙丹

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

At. ferrooxidans 是一種以Fe2+或低價態(tài)硫作為能源生長、革蘭氏染色陰性、端生鞭毛具運動性的化能自養(yǎng)菌[1-2]。固定化At. ferrooxidans 在酸性礦坑廢水和H2S 等廢氣的治理中具有廣泛的應(yīng)用[3]。由于游離At. ferrooxidans 在廢氣處理中存在損失量大、氣體處理量小等缺點，目前主要開發(fā)固定化At. ferrooxidans用于H2S 的脫除和Fe2+的再生。因此，研究At. ferrooxidans 的固定化對于H2S 的處理工藝至關(guān)重要。海藻酸鈉具有價格低廉，對細胞毒性相對較小，固定化容易成形，傳質(zhì)性能好，性質(zhì)穩(wěn)定，且對微生物細胞的富集程度高等優(yōu)點，而成為目前應(yīng)用最廣的包埋劑之一[4]。

實驗以At. ferrooxidans 為包埋對象，以海藻酸鈉為包埋載體，CaCl2為交聯(lián)劑，制備海藻酸鈉固定化凝膠珠。考察了海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、硝酸鈣濃度及細胞數(shù)量對Fe2+氧化率的影響，并確定最佳固定化條件。

1 材料

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

At. ferrooxidans ATCC23270。

1.1.2 培養(yǎng)基

0 K 液體培養(yǎng)基[5]：（NH4）2SO43.0 g，KCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Ca（NO3）20.01 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 至1.8，121 ℃滅菌15 min。

9 K 液體培養(yǎng)基[5-6]：0 K 液體培養(yǎng)基內(nèi)加入經(jīng)過濾除菌的FeSO4·7H2O（調(diào)整pH 至1.8），使Fe2+終濃度為8.9 g·L-1。

1.1.3 主要試劑和儀器

海藻酸鈉（化學(xué)純，溫州市東升化工試劑廠）；Ca（NO3）2（分析純，沈陽市華東試劑廠）；CaCl2（分析純，沈陽市華東試劑廠）。

PHSJ-3F 型實驗室pH 計（上海雷磁儀器廠）；KD-S14 電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；HZQ-C 空氣浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的At. ferrooxidans，按10%接種量分別接種到5 份盛有9 K 培養(yǎng)基的三角瓶中，恒溫30 ℃空氣震蕩培養(yǎng)48～72 h（150 rpm）。所得培養(yǎng)液1 500 rpm 離心5 min，棄去沉淀，上清液12 000 rpm離心15 min，收集細胞。去離子水溶解細胞，制得細胞懸液。

2.2 細胞固定化

將配制好的一定濃度的海藻酸鈉40 mL 煮沸20 min，冷卻至30 ℃。加入一定濃度的細胞懸液，充分攪拌，待菌株與海藻酸鈉充分混合后，靜置30 min。在10 cm 高處，用9 號針頭將海藻酸鈉和At. ferrooxidans 的混合液，逐滴勻速滴入到一定濃度的交聯(lián)劑中，固定2 h，雙層紗布過濾，棄液體。pH 2.0稀硫酸反復(fù)沖洗5 次，轉(zhuǎn)至含新鮮配制的9 K 培養(yǎng)基中，恒溫30 ℃空氣震蕩培養(yǎng)72 h（150 rpm），測定Fe2+氧化率。

2.3 細胞固定化影響因素分析

2.3.1 交聯(lián)劑種類及濃度對細胞固定化的影響

交聯(lián)劑選用Ca（NO3）2，設(shè)置2%、3%、4%、5%、6%五個濃度，按上述方法制備At. ferrooxidans 固定化細胞并測定其對Fe2+的氧化。交聯(lián)劑選用CaCl2，設(shè)置2%、3%、4%、5%、6%5 個濃度，按上述方法制備At. ferrooxidans 固定化細胞并測定其對Fe2+的氧化。

2.3.2 海藻酸鈉濃度對細胞固定化的影響

分別配制濃度為1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的海藻酸鈉，按上述方法制備At. ferrooxidans 固定化細胞并測定其對Fe2+的氧化。

2.3.3 At. ferrooxidans 細胞濃度對細胞固定化的影響At. ferrooxidans 細胞濃度分別設(shè)置為3×108、6×108、9×108、1.2×109及1.5×109cell·mL-1，按上述方法制備At. ferrooxidans 固定化細胞并測定其對Fe2+的氧化。

2.4 Fe2+氧化率測定

Fe2+濃度的測定采用重鉻酸鉀滴定法[7]。

3 結(jié)果與討論

3.1 交聯(lián)劑種類及濃度

Ca（NO3）2和CaCl2是兩種常用交聯(lián)劑，為了探討其對At.ferrooxidans 固定化效果，分別選取不同濃度的Ca（NO3）2和CaCl2作為交聯(lián)劑，制成At. ferrooxidans固定化細胞，以其對Fe2+的氧化率作為檢測指標(biāo)，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，隨著交聯(lián)劑濃度的增加，F(xiàn)e2+的氧化率逐漸減小，實驗中我們發(fā)現(xiàn)，以Ca（NO3）2為交聯(lián)劑制成的凝膠珠堅硬，機械力強。CaCl2的濃度大于2%時，制成的凝膠珠過于緊實，使底物和產(chǎn)物的擴散相對困難。

相同濃度的CaCl2與Ca（NO3）2作交聯(lián)劑時，制得的凝膠珠形狀均較好，且機械力強，但以前者為交聯(lián)劑制得的凝膠珠對Fe2+的氧化率遠大于后者。因此，后續(xù)的實驗中選用的交聯(lián)劑為2%的CaCl2。

圖1 不同濃度Ca（NO3）2 和CaCl2 對Fe2+氧化率的影響Fig.1 The effect of calcium nitrate and calcium chloride with different concentrates of oxidize rate for Fe2+

3.2 海藻酸鈉濃度

選取CaCl2濃度為2%，細胞濃度為1×109，海藻酸鈉濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%進行細胞固定化實驗。通過海藻酸鈉濃度的改變，觀察其對Fe2+的氧化情況，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，2.5%的海藻酸鈉對Fe2+的氧化率最高。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)海藻酸鈉濃度低于2%時，制得的凝膠珠形狀不規(guī)則，且較松軟，機械強度低，所包含的細胞數(shù)目較少；隨著海藻酸鈉濃度的升高，制得的凝膠珠形狀成規(guī)則的圓球狀，但隨著海藻酸鈉濃度的增加，使得溶液粘度增加，導(dǎo)致針頭堵塞，凝膠珠形成困難。海藻酸鈉的濃度為2.5%時，形成的凝膠珠大小均勻，對Fe2+的氧化效果較好。

圖2 海藻酸鈉濃度對Fe2+氧化率的影響Fig.2 The effect of sodium alginate concentrate of oxidize rate for Fe2+

3.3 At. ferrooxidanscells 細胞濃度

取濃度為2%的CaCl2，海藻酸鈉濃度為2.5%，細胞 終 濃 度 分 別 為3×108、6×108、9×108、1.2×109、1.5×109，進行細胞固定化實驗。通過調(diào)整細胞終濃度，研究其對Fe2+的氧化率的影響，結(jié)果見圖3。由圖可知，細胞濃度為1.2×109時，F(xiàn)e2+的氧化效果最好。隨著細胞濃度的增加，F(xiàn)e2+的氧化率呈先升高后降低的趨勢，其主要原因是海藻酸鈉對細胞的包埋具有飽和性，當(dāng)細胞濃度超過1.2×109時，海藻酸鈉包埋的細胞制得的凝膠珠傳質(zhì)及傳氧性變差。

4 結(jié)論

海藻酸鈉- 氯化鈣能較好的固定At. ferrooxidanscells 菌株，最佳固定化條件為：CaCl2濃 度 為 2% ， 海 藻 酸 鈉 濃 度 為 2.5% ，At. ferrooxidanscells 細胞濃度為1.2×109cell·mL-1，對Fe2+的氧化率分別為99.83%、99.62%、99.42%。該方法制得的凝膠珠性質(zhì)穩(wěn)定，機械強度好，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

圖3 A.f 細胞數(shù)量對Fe2+氧化率的影響Fig.3 The effect of cell concentrate for the oxidize rate of Fe2+

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