格氏乳球菌素LG34 生物穩(wěn)定性的研究

劉姍，高玉榮

（黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 163319）

細菌素是細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有抑菌活性的肽或前體，通常認為它只作用于與產生菌同種的其他菌株或與其親緣關系很近的物種[1]。鑒于乳酸菌產生的細菌素具備高效、體內無殘留、無抗藥性及不污染環(huán)境等特點，近年來被推薦作為生物型的防腐劑用于食品的保藏當中[2]。目前只有Nisin[3]和pediocin PA-1/AcH 在工業(yè)中有應用，但由于這些細菌素只對大多數革蘭氏陽性細菌有抑制作用，但對革蘭氏陰性細菌無作用，而且在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，這使得目前乳酸菌細菌素的應用范圍較窄，限制了其在食品中的應用[4]。因此開發(fā)新型廣譜、抗菌活性強，穩(wěn)定性強的乳酸菌細菌素已成為目前的發(fā)展趨勢。在前期實驗中已從發(fā)酵酸黃瓜中篩選出了一株產新型廣譜細菌素的Lactococcus garvieae LG34，并對其產生的格氏乳球菌素LG34 進行了分離純化。對其抑菌譜及溫度、酶、酸堿、無機鹽、有機溶劑、表面活性劑對其生物穩(wěn)定性的影響進行了研究，為其在食品中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

Lactococcus garvieae LG34：從發(fā)酵酸黃瓜中篩選得到一株產廣譜細菌素的乳酸菌。

抑菌譜所用菌（見表1）：黑龍江八一農墾大學微生物實驗室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，K2HPO4·3H22 g，乙酸鈉5 g，CaCO35 g，檸檬酸三銨2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，吐溫-80 1 mL，pH 6.5。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，pH7.2～7.4。

指示菌上層培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨8 g，瓊脂0.8 g，pH 值為7.4～7.6。

指示菌下層培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨8 g，瓊脂1.5 g，pH 值為7.4～7.6。

1.3 細菌素樣品的制備

將保存在MRS 斜面培養(yǎng)基的Lactococcus garvieae LG34 挑取1～2 環(huán)轉接到10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃靜置培養(yǎng)16～18 h，按2%～3%擴大培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液在4 000 r·min-1下離心20 min，將無細胞上清液調pH 至6.0，旋轉蒸發(fā)濃縮10 倍。加入4 倍體積預冷至-20 ℃無水乙醇過夜沉淀，再將濃縮液旋轉蒸發(fā)濃縮2 倍。

1.4 格氏乳球菌素LG34 抗菌譜測定

分別選取G+、G-、霉菌、酵母菌為指示菌，采用瓊脂擴散法測定格氏乳球菌素的抑菌效果。

1.5 溫度、蛋白酶及pH 對格氏乳球菌素LG34 的影響

將格氏乳球菌素LG34 在80、90、100 ℃分別處理30 min 和60 min，121 ℃處理30 min 后，以未經熱處理的作為對照，測定熱處理后的格氏乳球菌素LG34 對金黃葡萄球菌的抑菌活性。

將胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別溶解在20 mmol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.6、pH 2.0、pH 6.2、pH 7.0、pH 7.0）中配成酶母液，分別加入格氏乳球菌素LG34 提取液，使酶終濃度為5 mg·mL-1，在37 ℃水浴中溫浴5 h，取出后將pH 調到6.0，以金黃色葡萄球菌為指示菌，用瓊脂擴散法檢測抑菌活性，以未加酶處理的樣品作為對照，檢測各種蛋白酶對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

將格氏乳球菌素LG34 樣品的pH 值用1 mol·L-1NaOH 和1 mol·L-1HCl 分別調整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，經12 h 作用后將pH 值調至6.0，以未處理的細菌素樣品為空白對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測定pH 對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

1.6 無機鹽、有機溶劑及表面活性劑對格氏乳球菌素LG34 的影響

分別將0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mol·L-1的NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、CuSO4加入格氏乳球菌素LG34 粗提液中，搖勻后靜置4 h，采用瓊脂擴散法測定無機鹽對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

將10%、20%、30%、40%、50%體積的氯仿、丙酮、乙醚、甲苯、異丙酮加入格氏乳球菌素LG34 粗提液中，搖勻后靜置4 h，測定有機溶劑對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

分別將10%、20%、30%、40%、50%體積的甘油、吐溫-80 加入格氏乳球菌素LG34 粗提液中，搖勻后靜置4 h，測定表面活性劑對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

1.7 統計分析

2 結果與分析

2.1 細菌素抑菌譜的測定

由表1 可見，格氏乳球菌LG34 的抑菌譜較廣，除枯草芽孢桿菌外，對大多數革蘭氏陽性菌均有抑制作用，而且對革蘭氏陰性菌也有抑制作用，但不抑制霉菌和酵母菌。

2.2 溫度對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響

由圖1 可以看出，格氏乳球菌素LG34 對熱很穩(wěn)定，在經121 ℃處理30 min 后抑菌活性僅降低了10.5%。敖靈[5]研究的戊糖乳桿菌C50-6 菌株產細菌素和單春喬等[6]研究的嗜酸乳桿菌產細菌素對熱很穩(wěn)定，在121 ℃處理20 min 后仍能保持80%以上的活性。因此在食品生產與加工業(yè)進行殺菌處理的過程中，不會導致細菌素抑菌活性的喪失。

表1 Garviecin LG34 的抑菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of garviecin LG34

圖1 溫度對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Fig.1 Effect of temperature on the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

2.3 蛋白酶對格氏乳球菌素LG34 活性的影響

表2 蛋白酶對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Table 2 Effect of enzymes to antimicrobial activity of Lactococcus garvieae LG34

由表2 可以看出，格氏乳球菌素LG34 經胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后抑菌作用減弱，但并沒有消失，其中經胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后的抑菌活性損失率分別為61.3%和62.9%，說明格氏乳球菌素LG34 對胃蛋白酶和胰蛋白酶具有較強敏感性，而對其他三種酶具有弱的敏感性。由于細菌素是一種蛋白類物質，當細菌素作為生物防腐劑隨食物進入人體消化道時可被蛋白酶降解而不會在體內殘留，具有較高的安全性。

2.4 pH 對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響

除此之外，還針對河道的化學需氧量、氨氮量以及總氮量等指標進行了檢測，結果顯示各項指標均明顯優(yōu)于河道治理工作開展前，說明生物生態(tài)修復治理工作在水系水體環(huán)境的治理工作中發(fā)揮出了較好的應用效果，為提高普陀區(qū)桃浦鎮(zhèn)北環(huán)水系水體治理水平產生了積極影響。

圖2 pH 對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH on the antibacterial activity for Lactococcus garvieae LG34

由圖2 表明，格氏乳球菌素LG34 的抗菌活性在pH 2.0～8.0 具有較好的穩(wěn)定性，在pH 2.0 處理后活性僅損失18%，說明格氏乳球菌素LG34 具有較好的耐酸能力；在中性條件下格氏乳球菌素LG34 抑菌效果最好，但當pH 大于9.0 后抑菌活性損失較大，在pH 值11.0 時抑菌活性最弱。國內，李琳等[7]研究的細菌素ST9 和陳靜等[8]研究的嗜酸乳桿菌產細菌素，國外Jamuna M 等[9]研究的乳酸片球菌素和Todorov等[10]研究的類細菌素，在酸性至中性條件下都具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 無機鹽對細菌素抑菌活性的影響

圖3 無機鹽對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

由圖3 可以看出，無機鹽對格氏乳球菌素LG34抑菌活性的影響顯著，抑菌活性的損失隨著無機鹽濃度的提高而增大。這5 種無機鹽對格氏乳球菌素LG34 的影響大小依次為：KCl＞CaCl2＞MgSO4＞NaCl＞CuSO4。韓誠武[11]對副干酪乳桿菌素的研究表明Na+、K+一價金屬離子對副干酪乳桿菌素活性的影響較小，而Mg2+、Ca2+二價金屬離子降低了副干酪乳桿菌素的活性。

2.6 有機溶劑對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響

由表3 可見，添加10%～50%的有機溶劑對抑菌活性的影響不顯著。通過單因素方差分析所得的P值在0.05 水平上影響差異不顯著。在李亞玲[12]的乳酸片球菌細菌素分離純化及理化性質研究文章中結果表明有機溶劑對細菌素抑菌活性影響不顯著，與結果基本一致。

2.7 表面活性劑對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響

表3 有機溶劑加量對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Table 3 Effect of the amount of organic solvent to the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

表4 表面活性劑吐溫80 和甘油對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Table 4 Effect of surfactant Tween 80 and glycerol to the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

由表4 可見，添加表面活性劑吐溫80、甘油后對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響不顯著。

3 結論

3.1 試驗驗證了格氏乳球菌LG34 的抑菌譜較廣，既能抑制革蘭氏陽性菌，也能抑制革蘭氏陰性菌。

3.2 格氏乳球菌產細菌素LG34 具有較好的耐熱特性，在80、90 和100 ℃分別處理30 min 和60 min后，抑菌活性損失不到10%，121 ℃處理30 min 后僅損失10.5%；格氏乳球菌素LG34 對胃蛋白酶和胰蛋白酶具有較強敏感性，對中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶具有較弱的敏感性；格氏乳球菌素LG34具有較好的耐酸特性，pH 值在2.0～8.0 時均能保持穩(wěn)定的抑菌活性，抑菌活性損失小于20%。

3.3 KCl、NaCl、MgSO4、CaCl2、CuSO4對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性影響顯著，影響大小依次為：KCl＞CaCl2＞MgSO4＞NaCl＞CuSO4；有機溶劑甲苯、丙酮、乙醚、石油醚、氯仿及表面活性劑甘油、吐溫80 對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性影響不顯著。

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