參麥注射液對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

陳 昕，趙 雷，孫 波，韓蘊(yùn)琪，石 毅，周余來

（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.麻醉科，廣東 深圳518020；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程教研室，吉林 長春130021）

在細(xì)胞水平進(jìn)行心肌損傷保護(hù)研究是近年熱點(diǎn)，其最大優(yōu)點(diǎn)在于排除了體內(nèi)心臟實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭腥砩窠?jīng)體液等的影響，以及心臟不同類型細(xì)胞間的相互作 用［1，2］。阿霉素（adriamycin，ADM）屬蒽環(huán)類抗腫瘤藥，臨床上用于白血病、淋巴瘤、硬癌等的治療，效果顯著，但長期應(yīng)用可發(fā)生心臟毒性效應(yīng)，其臨床應(yīng)用受到限制［3］。本研究考察了阿霉素對(duì)原代培養(yǎng)的Wistar大乳鼠心肌細(xì)胞的損傷作用，并觀察參麥注射液（SMI）對(duì)此損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

出生24h內(nèi)Wistar大鼠，清潔級(jí)，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物飼養(yǎng)合格證號(hào)：NO：0010281）；新生小牛血清、MEM 培養(yǎng)基由GIBCO公司提供；胰蛋白酶由HYCLONE公司提供；鹽酸阿霉素為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品（產(chǎn)品批號(hào)：061102）；參麥注射液為河北神威藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（產(chǎn)品批號(hào)：070216）；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒、一氧化氮合成酶（NOS）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒為南京建成生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳鼠心肌原代培養(yǎng) 取出生24h內(nèi)的Wistar大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液中，加入10%滅活胎牛血清，細(xì)胞濃度1×105／ml，每孔200 μl接種至96孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后觀察細(xì)胞，當(dāng)心肌細(xì)胞貼壁后，換液。在培養(yǎng)48h后，可見心肌細(xì)胞連接成片，并產(chǎn)生有節(jié)律的自主跳動(dòng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及造模給藥 細(xì)胞培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)的細(xì)胞分組給藥。空白對(duì)照組加MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；損傷模型組加阿霉素濃度為2μg／ml的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；參麥注射液保護(hù)組分設(shè)3個(gè)濃度梯度，分別為100μl 10μg／ml的參麥注射液保護(hù)培養(yǎng)液＋100μl 2μg／ml阿霉素?fù)p傷培養(yǎng)液、100μl 20μg／ml的參麥注射液保護(hù)培養(yǎng)液＋100μl 2μg／ml阿霉素?fù)p傷培養(yǎng)液和100μl 40μg／ml的參麥注射液保護(hù)培養(yǎng)液＋100μl 2μg／ml阿霉素?fù)p傷培養(yǎng)液。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

心肌細(xì)胞培養(yǎng)24h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞的生長狀態(tài)以及細(xì)胞的搏動(dòng)率。

1.3.2 細(xì)胞損傷生化指標(biāo)測定 在心肌細(xì)胞給藥培養(yǎng)48h后，按試劑盒說明書檢測培養(yǎng)液上清LDHI和NOS含量；檢測培養(yǎng)心肌細(xì)胞超聲破碎得到細(xì)胞混懸液檢測MDA的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS V13.0進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)。多組間的比較用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

空白對(duì)照組心肌細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞邊緣清晰，相互連接成片，搏動(dòng)節(jié)律一致，搏動(dòng)頻率為60－80次／min。損傷模型組細(xì)胞形態(tài)改變明顯，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞的邊緣不清晰，細(xì)胞間的連接被破壞，自主節(jié)律跳動(dòng)變?yōu)榉峭降墓?jié)律不齊的跳動(dòng)，搏動(dòng)頻率為30－40次／min。藥物保護(hù)組心肌細(xì)胞未裂解，仍有自主性搏動(dòng)，但細(xì)胞仍有部分損傷。搏動(dòng)頻率為40－60次／min。

2.2 參麥注射液對(duì)阿霉素致心肌損傷的保護(hù)作用

各組細(xì)胞給藥后培養(yǎng)達(dá)48h時(shí)，損傷對(duì)照組心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH、NOS和MDA含量明顯增加，與正常組比較差異非常顯著（P＜0.01）；而在參麥注射液3個(gè)劑量保護(hù)組，LDH和NOS含量較ADM損傷模型組依次降低，且降低呈現(xiàn)劑量依賴性；在參麥注射液保護(hù)低劑量組MDA指標(biāo)改善不明顯，而中、高劑量組與ADM組比較MDA含量明顯改善，見表1。

表1 不同濃度參麥注射液對(duì)心肌細(xì)胞的影響

3 討論

阿霉素是一種臨床上廣泛應(yīng)用的抗癌藥物，對(duì)乳腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌等有較好的療效，是治療實(shí)體腫瘤最有效的藥物之一［3］。但在它的藥物代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，對(duì)人體各器官（尤其是心臟）產(chǎn)生毒性作用。阿霉素在心肌細(xì)胞中通過細(xì)胞色素P450和黃素單氧合酶轉(zhuǎn)化為半醌阿霉素。半醌阿霉素具有毒性，并可與分子氧相互作用，觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其他的細(xì)胞成分相互作用，導(dǎo)致線粒體和心肌細(xì)胞膜的損傷，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)、蛋白質(zhì)的功能受抑制、核酸和染色體被破壞，從而嚴(yán)重影響細(xì)胞各種功能［4］。本研究應(yīng)用培養(yǎng)的心肌細(xì)胞觀察了ADM對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用，結(jié)果顯示，ADM可使培養(yǎng)的心肌細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)改變明顯，細(xì)胞的邊緣不清晰，細(xì)胞間的連接被破壞，自主節(jié)律跳動(dòng)消失，變?yōu)榉峭降墓?jié)律不齊的跳動(dòng)；ADM損傷組乳酸脫氫酶（LDH）含量、一氧化氮合酶（NOS）含量、丙二醛（MDA）含量明顯高于空白對(duì)照組。

在正常情況下，體內(nèi)存在清除自由基和抑制自由基的酶體系（如SOD、CAT等），使之維持自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，防止自由基損傷［4］。為了減輕阿霉素的毒副作用，尋找有效的心臟保護(hù)藥物，對(duì)發(fā)揮阿霉素的抗癌效果具有重要的意義。有研究表明，參麥注射液能夠降低阿霉素所致心肌損傷，對(duì)心肌細(xì)胞起到了有效的保護(hù)作用［5］。

參麥注射液源自古方“生脈散”，主要成分為人參和麥冬。中醫(yī)認(rèn)為有益氣固脫、養(yǎng)陰生津之功效。臨床及藥理研究顯示其具有強(qiáng)壯抗疲勞、抗放射、促進(jìn)造血功能、保護(hù)心肌抗休克以及增強(qiáng)免疫功能等作用［6］。麥冬含多種抗氧化物質(zhì)，如皂苷、黃酮、多糖以及銅、鋅等微量元素，均有不同程度清除自由基作用。人參有效成分人參皂苷有明顯的心肌保護(hù)作用，它能夠抑制缺血再灌注損傷，減少心肌酶的漏出量。人參甲醇提取物中的麥芽醇、水楊酸、草香酸有明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用。麥芽醇不僅能捕捉自由基，具有抗氧化作用，該化合物可以減少膜蛋白分子中巰基的外露，從而穩(wěn)定了膜蛋白的結(jié)構(gòu)［5］。

本實(shí)驗(yàn)采用乳鼠心臟細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)并從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、乳酸脫氫酶含量、一氧化氮合成酶含量、丙二醛含量等方面觀察了參麥注射液對(duì)ADM中毒心肌細(xì)胞的保護(hù)。體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞經(jīng)阿霉素造成損傷后，其代謝和功能等都受到影響，其中LDH的外漏可作為損傷判斷的重要依據(jù)。LDH一直被認(rèn)為是細(xì)胞能量代謝的標(biāo)志性酶之一。LDH產(chǎn)生于線粒體，心肌細(xì)胞培養(yǎng)液之中的LDH是由線粒體膜破裂導(dǎo)致酶外漏而產(chǎn)生的［7］。很多實(shí)驗(yàn)資料說明，阿霉素對(duì)心肌的毒性效應(yīng)來源于氧自由基，線粒體是其心臟毒性的主要部位［8］。與ADM同時(shí)給予的不同濃度的參麥注射液不同程度地減少了由于ADM損傷造成的LDH的漏出，改善了中毒心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率。參麥注射液對(duì)ADM中毒的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與其改善線粒體酶功能有關(guān)，加強(qiáng)氧化磷酸化過程，提高所需能量，從而維持了心肌細(xì)胞節(jié)律性搏動(dòng)等重要生理功能［9］。本研究表明參麥注射液可保護(hù)阿霉素引起的心肌細(xì)胞損傷，減少乳酸脫氫酶的漏出和改善心肌細(xì)胞的搏動(dòng)情況，其機(jī)制與保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體有關(guān)。

一氧化氮合酶（NOS）是另一衡量心肌細(xì)胞代謝狀態(tài)的重要指標(biāo)，可由阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合酶（NOS）可使細(xì)胞產(chǎn)生NO增加，與阿霉素致心肌細(xì)胞產(chǎn)生增加的O2－反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子（ONOO－）。ONOO－是一種強(qiáng)氧化劑，可迅速分解為高活性的OH－和NO等自由基，參與脂質(zhì)過氧化。本實(shí)驗(yàn)中，損傷模型組的NOS含量高于空白對(duì)照組，說明損傷模型組心肌細(xì)胞受阿霉素氧化損傷后被誘導(dǎo)產(chǎn)生較多NOS。而在參麥注射液保護(hù)組，該指標(biāo)明顯較低，表示參麥注射液能夠有效的抑制NOS的誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而防止產(chǎn)生高活性的OH－和NO等自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，有效的保護(hù)了心肌細(xì)胞。

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要的最終產(chǎn)物，可進(jìn)攻蛋白分子的氨基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分子內(nèi)交聯(lián)和分子間交聯(lián)，使細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。MDA含量的增多，可表明脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，間接反映了自由基產(chǎn)生的多少［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予ADM后繼續(xù)培養(yǎng)24h后，損傷模型組的MDA含量明顯高于空白對(duì)照組，說明損傷模型組細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)過氧化損傷之后產(chǎn)生較多的MDA。參麥注射液保護(hù)組的MDA含量下降，與損傷模型組形成顯著的差異，說明參麥注射液可以有效的抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減少M(fèi)DA的產(chǎn)生。

在本實(shí)驗(yàn)中將參麥注射液與ADM同時(shí)應(yīng)用于培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，可明顯減輕ADM引起的損傷、保存細(xì)胞活力、維持相對(duì)規(guī)律的心肌搏動(dòng)。參麥注射液對(duì)ADM引起的心肌細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制與參麥注射液保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體及其酶系統(tǒng)有關(guān)。在應(yīng)用阿霉素等蒽環(huán)類藥物抗腫瘤治療的同時(shí)，輔以參麥注射液可以有效地控制ADM等引起的心臟毒性，為臨床應(yīng)用提供參考。

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