溫度調(diào)控誘導(dǎo)尼羅羅非魚(yú)仔魚(yú)雄性化的研究*

陳興漢，劉曉春，蒙子寧，張 勇，葉 衛(wèi)，林浩然

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275;2.陽(yáng)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系，廣東陽(yáng)江 529566;3.番禺國(guó)家級(jí)羅非魚(yú)良種場(chǎng)，廣東廣州 511453）

羅非魚(yú)屬鱸形目Perciformes;鱸形亞目Percoidei;麗魚(yú)科Cichidae;羅非魚(yú)屬Oreochromis。具有肉味鮮美、生長(zhǎng)快、病害少、養(yǎng)殖成本低以及適合淡水和海水養(yǎng)殖等許多優(yōu)點(diǎn)，養(yǎng)殖地區(qū)已遍布世界各地。近年來(lái)中國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)量穩(wěn)居世界第一位、也是世界上最大的羅非魚(yú)出口國(guó)、居我國(guó)水產(chǎn)品出口總量第3位［1］。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，羅非魚(yú)顯露出了作為產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖和世界大宗貿(mào)易對(duì)象的潛力［2］。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織將羅非魚(yú)作為“有希望的養(yǎng)殖魚(yú)”加以推廣，被稱為“21世紀(jì)之魚(yú)”［3］。但在羅非魚(yú)的養(yǎng)殖推廣中最突出的限制性因素是“繁殖過(guò)度”，其性成熟早、一個(gè)養(yǎng)殖季節(jié)可自行繁殖好幾代，致使商品魚(yú)品質(zhì)偏低、資源浪費(fèi)嚴(yán)重。同時(shí)羅非魚(yú)是雄性優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)種類(lèi)，雄魚(yú)比雌魚(yú)生長(zhǎng)快40% ～50%［4］。因此，采用單雄性養(yǎng)殖是解決“繁殖過(guò)度”的關(guān)鍵。其技術(shù)難題是“如何通過(guò)性別控制手段以獲得雄性化魚(yú)苗”。近年來(lái)，在尼羅羅非魚(yú)中應(yīng)用較廣泛的是通過(guò)雄激素飼料拌喂的方式，這樣雖可以得到雄性率較高的魚(yú)苗，但激素的濫用嚴(yán)重危害了生態(tài)環(huán)境，且激素在魚(yú)肉中有一定殘留、人類(lèi)直接或間接食用后身體健康會(huì)受到影響。通過(guò)溫度調(diào)控的手段所得雄性化魚(yú)苗就不會(huì)產(chǎn)生這些危害。目前，關(guān)于溫度對(duì)羅非魚(yú)雄性率的影響只有少數(shù)幾位國(guó)外學(xué)者作過(guò)研究［5－6］，但國(guó)內(nèi)學(xué)者還沒(méi)有報(bào)道，生產(chǎn)上更是沒(méi)有應(yīng)用。

羅非魚(yú)性別決定系統(tǒng)復(fù)雜，除了性染色體，常染色體也參與性別決定;此外環(huán)境因素，如外源激素和溫度等也可影響其性別決定。溫度影響性別決定的現(xiàn)象稱之為溫度依賴型性別決定 (TSD，Temperature-dependent sex determination)，且溫度的影響只在某一特定階段起作用，稱之為溫度敏感期(TSP，Temperature sensitive period)。在水產(chǎn)動(dòng)物中，普遍存在著 TSD 的現(xiàn)象，Choo［7］和聶劉旺［8］研究表明中華鱉的性別決定屬于TSD類(lèi)型。

Conover和Heins［9］發(fā)現(xiàn)月銀漢魚(yú)在低溫條件下子代雌性偏多。Carlosa等［10］研究了兩種銀漢魚(yú)Odontesthes bonariensis和 Patagonina hatchery，發(fā)現(xiàn)O.bonariensis仔魚(yú)在13～19℃為100%雌魚(yú)，25℃則29.4%為雌魚(yú)，27℃時(shí)則只有10%為雌魚(yú)，29℃則為100%雄魚(yú);P.hatchery在13℃和15℃時(shí)雌魚(yú)分別占88.9%和89.5%，17～23℃之間雌魚(yú)占50%;25℃雌魚(yú)為30.8%。羅非魚(yú)，包括尼羅羅非魚(yú)、莫桑比克羅非魚(yú)和奧利亞羅非魚(yú)都有TSD的現(xiàn)象［5－6］。尼羅羅非魚(yú)和奧利亞羅非魚(yú)在高溫(34～37℃)時(shí)雄性率較高，而莫桑比克羅非魚(yú)則在低溫 (19～20℃)時(shí)雄魚(yú)比例偏高。Baroiller等［11］在尼羅羅非魚(yú)溫度敏感期 (不晚于受精后13 d)以36℃高溫處理魚(yú)持續(xù)10 d，雄性比例由53%增加到81%，在27℃下雌雄比例為1∶1，34℃下雄性比例不明顯增加。

本實(shí)驗(yàn)研究了尼羅羅非魚(yú)仔魚(yú)在溫度調(diào)控誘導(dǎo)下的雄性率，以及相應(yīng)的增質(zhì)量率和存活率。其主要意義在于:經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究，確立了一種新的通過(guò)“溫度調(diào)控”手段誘導(dǎo)尼羅羅非魚(yú)仔魚(yú)雄性化的技術(shù)方案，這在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道，較之前常用的激素投喂技術(shù)更環(huán)保、安全、高效。并且通過(guò)“溫度調(diào)控”誘導(dǎo)雄性化的效果是理想的，在雄性率高的同時(shí)、生長(zhǎng)率和成活率也不受影響，從而保證了這項(xiàng)技術(shù)可以在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

尼羅羅非魚(yú)仔魚(yú)取樣于廣東省國(guó)家級(jí)羅非魚(yú)良種場(chǎng) (番禺)。選取健壯、無(wú)病，魚(yú)體色發(fā)紅，卵粒圓大、發(fā)亮、金黃的雌魚(yú)作為母本;同時(shí)選擇健壯，無(wú)病，可擠出白色精液的雄魚(yú)作為父本。1雌1雄配養(yǎng)于約4 m×1.5 m×1.2 m(長(zhǎng)×寬×深)的水泥池中。投喂普通羅非魚(yú)成魚(yú)飼料，保持微流水。待卵成熟后，雌魚(yú)自行產(chǎn)卵受精，把卵含在口中進(jìn)行口腔孵化。在孵出前1～3 d，把卵從親魚(yú)口腔中取出。在孵化裝置中孵化。待仔魚(yú)全部孵出后，飼養(yǎng)于約40 cm×25 cm×25 cm(長(zhǎng)×寬×高)的白色塑料箱中。待仔魚(yú)生長(zhǎng)到出膜后第7天 (DPH，Days Post Hactching)，再分組進(jìn)行試驗(yàn)。所有的魚(yú)池、用品都做好常規(guī)消毒備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 尼羅羅非魚(yú)仔魚(yú)在自然水溫(26～30℃)條件下，生殖嵴形成于7 DPH左右，此時(shí)性腺尚未開(kāi)始分化、處于溫度敏感期開(kāi)始階段，故控溫處理從7 DPH開(kāi)始。實(shí)驗(yàn)時(shí)溫度設(shè)置為3個(gè)，分別為20、28、36℃ (±0.5℃);控溫時(shí)段也為3個(gè)，分別為7－14 DPH、7－21 DPH、7－28 DPH。進(jìn)行正交試驗(yàn)［12］，略修正;設(shè)置兩個(gè)平行組、另設(shè)兩個(gè)自然水溫對(duì)照組 (Ctr)，每組實(shí)驗(yàn)用魚(yú)80尾。

1.2.2 飼養(yǎng)方法 控溫處理實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用房約50 m2，需兩臺(tái)2 P功率的空調(diào)，以保證室溫能降至20℃。選取40 cm×25 cm×25 cm(長(zhǎng)×寬×高)的塑料箱作為飼養(yǎng)箱;每個(gè)溫度梯度用3個(gè)箱，兩個(gè)作為平行組，剩下一個(gè)裝有同樣溫度的水，以作換水備用;每個(gè)箱里裝一只250～300 W的恒溫調(diào)節(jié)加熱器 (RTR 250/300，SICCE)和一支溫度計(jì)，水溫浮動(dòng)范圍為±0.5℃;另每個(gè)箱裝一個(gè)充氣石，以保證溶氧和水溫均勻。待7 DPH時(shí)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每天虹吸箱底兩次、早晚各一次;期間，每天換水一次，每次換水量為1/3?？販貙?shí)驗(yàn)結(jié)束后把魚(yú)飼養(yǎng)于50 cm×50 cm×50 cm的網(wǎng)箱中，網(wǎng)箱懸掛于水泥池中，保持微流水，每天清洗網(wǎng)箱一次。每天投喂鰻魚(yú)飼料3次，采取過(guò)量投喂法［13］，以避免因搶食引起的個(gè)體生長(zhǎng)分化。一直把魚(yú)飼養(yǎng)到可以壓片檢測(cè)性腺雌雄為止，一般為期60 d。

1.2.3 體質(zhì)量測(cè)量和性腺檢測(cè) 分別于7、14、21、28和60 DPH稱量體質(zhì)量，每個(gè)平行組隨機(jī)取15尾魚(yú)，快速用吸水紙吸干體表水分、放于濾紙上稱量，然后放回原實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)飼養(yǎng)。60 DPH體質(zhì)量采用百分之一電子天平 (SETRA，BL－2000)、精確到0.1 g;其它都采用萬(wàn)分之一分析天平 (SETRA，BL－200S)、精確到0.1 mg。

待魚(yú)性腺生長(zhǎng)發(fā)育到可通過(guò)壓片分辨雌雄時(shí)(60 DPH)，人工解剖取性腺，解剖前向魚(yú)體腔注射約1 mL的體積分?jǐn)?shù)為5%的醋酸溶液，使性腺顯白色，以利于取出性腺。性腺取出后，滴少許鐵醋酸洋紅進(jìn)行染色，壓片后在ZEISS顯微鏡下觀察判斷雌雄。雌魚(yú)性腺表面可見(jiàn)清晰卵粒 (圖1);雄魚(yú)性腺表面無(wú)清晰細(xì)胞間隔 (圖2)。如壓片不能清楚分辨雌雄時(shí)，揭開(kāi)蓋玻片，滴少許結(jié)晶紫溶液，如果是雌性，則可見(jiàn)明顯卵細(xì)胞;無(wú)卵細(xì)胞樣的則為雄性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，并運(yùn)用SPSS18.0版本進(jìn)行差異顯著性分析。用卡方 (х2)檢驗(yàn)［14］比較各組的存活率、雄性率的差異，進(jìn)行多重比較時(shí)，為了降低Ⅰ類(lèi)誤差，需對(duì)比較平準(zhǔn)進(jìn)行校正，校正的比較平準(zhǔn)為α'=α/比較次數(shù)。用Duncan氏檢驗(yàn)［14］比較體質(zhì)量和絕對(duì)增質(zhì)量率的差異。絕對(duì)增質(zhì)量率按下式計(jì)算:

式中:W1，初始體質(zhì)量;W2，終末體質(zhì)量;t1，控溫結(jié)束時(shí)間;t2，60 DPH。

2 結(jié)果

2.1 溫度調(diào)控誘導(dǎo)雄性化

由各控溫時(shí)段、各溫度條件下雄性率的兩兩比較 (圖3)可知:當(dāng)溫度為36℃時(shí)，3個(gè)控溫時(shí)段7－14 DPH、7－21 DPH、7－28 DPH的雄性率較其它各組的雄性率顯著提高、與對(duì)照組有顯著差異 (P＜0.05)，分別高達(dá) 93.85%、96.00%、96.92%;這3個(gè)組之間的雄性率沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。其它各組兩兩比較沒(méi)有顯著差異、與對(duì)照組均沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05)。

圖3 3種溫度條件下、不同處理時(shí)段雄性率的比較Fig.3 The male ratio of the different diposal groups at three different temperature

2.2 控溫對(duì)增質(zhì)量率的影響

由控溫時(shí)段結(jié)束至60 DPH的終末體質(zhì)量組內(nèi)組間比較、絕對(duì)增質(zhì)量率的組內(nèi)比較 (表1)可知，初始體質(zhì)量大小排序?yàn)?Ctr＞28℃ ＞36℃ ＞20℃，組內(nèi)兩兩比較有顯著差異 (P＜0.05)。60 DPH時(shí)，終末體質(zhì)量的組內(nèi)、組間比較結(jié)果如下:當(dāng)控溫時(shí)段為7－14 DPH時(shí)，28℃的終末體質(zhì)量和對(duì)照組沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05)、36℃與28℃的終末體質(zhì)量沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05)、20℃與36℃的終末體質(zhì)量也沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05);其它各組的終末體質(zhì)量都有顯著差異 (P＜0.05)。

控溫時(shí)段結(jié)束至60 DPH的絕對(duì)增質(zhì)量率組內(nèi)比較結(jié)果如下:當(dāng)控溫時(shí)段為7－14 DPH時(shí)，28℃、36℃的絕對(duì)增質(zhì)量率與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，20℃與36℃的絕對(duì)增質(zhì)量率沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05);其它各組絕對(duì)增質(zhì)量率組內(nèi)比較都有顯著差異 (P＜0.05)。

2.3 控溫對(duì)存活率的影響

由各控溫時(shí)段、各溫度條件下存活率的兩兩比較 (圖4)可知:當(dāng)處理組合 (溫度+控溫時(shí)段)為(20℃+7－21 DPH)和(20℃+7－28 DPH)時(shí)，成活率較其它各組顯著降低、與對(duì)照組有顯著差異 (P＜0.05)，分別和其它各組都有顯著差異(P＜0.05)，這兩組之間沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05);其它各組的存活率比較沒(méi)有顯著差異、與對(duì)照組也沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05)。

表1 控溫時(shí)段結(jié)束至60DPH，終末體質(zhì)量的組內(nèi)組間比較、絕對(duì)增質(zhì)量率的組內(nèi)比較1)Table 1 The comparison of end weight and AGR from the time of end processing to 60DPH at different water temperature

圖4 3種溫度條件下、不同處理時(shí)段成活率的比較Fig.4 The survival ratio of the different diposal groups at three different temperature

3 討論

3.1 溫度調(diào)控誘導(dǎo)雄性化

本研究中，當(dāng)溫度為36℃時(shí)，3種控溫時(shí)段7－14 DPH、7－21 DPH、7－28 DPH的雄性率顯著增高、分別高達(dá)93.85%、96.00%、96.92%，這3組之間雄性率沒(méi)有顯著差異。這可以說(shuō)明3個(gè)方面的問(wèn)題:①溫度為36℃時(shí)，可以顯著提高雄性率;②3種處理持續(xù)時(shí)間 (7、14、21 d)長(zhǎng)短的不同對(duì)雄性率無(wú)顯著影響;③3種控溫時(shí)段 (7－14 DPH、7－21 DPH、7－28 DPH)均可顯著提高雄性率、且無(wú)顯著差異，據(jù)此可判斷溫度敏感期在7－14 DPH這段時(shí)間內(nèi)。在爬行動(dòng)物中溫度敏感期和激素敏感期大致平行［15－17］。根據(jù)我們之前的研究結(jié)果，尼羅羅非魚(yú)溫度敏感期和激素敏感期也基本平行［18］。這應(yīng)該與特定條件下溫度和激素有著共同的生理途徑有關(guān)。

Baroiller［11］在尼羅羅非魚(yú)溫度敏感期 (不晚于受精后13 d)以36℃處理10 d，雄性率由53%增加到81%。本研究所采用溫度與之相同、都為36℃，處理持續(xù)時(shí)間也基本吻合。從誘導(dǎo)雄性化效果來(lái)看，本研究中雄性率更高。雄性率的差異可能是由于控溫處理開(kāi)始時(shí)間有所不同引起的，控溫處理開(kāi)始時(shí)間不同、溫度敏感性就會(huì)有所差異。溫度敏感性的差異可能是由TSD性別決定機(jī)制來(lái)決定的。TSD性別決定的機(jī)制十分復(fù)雜，至今在學(xué)術(shù)界還沒(méi)有統(tǒng)一答案，大致機(jī)制可能如此:溫度會(huì)影響某些性別決定基因的表達(dá)或活性，或者改變了某些基因表達(dá)產(chǎn)物的構(gòu)象、抑或作為修飾劑改變分子的空間構(gòu)型，這些產(chǎn)物作為關(guān)鍵時(shí)期雄性決定因子 (Male Determine Factor，MDF)積累到一定水平時(shí)，就朝雄性方向發(fā)展、否則就發(fā)育為雌性。

Ewert和Nelson［17］將TSD總結(jié)為3種類(lèi)型:在低溫下產(chǎn)生雄性，在高溫下產(chǎn)生雌性、即MF模式;在低溫下產(chǎn)生雌性，在高溫下產(chǎn)生雄性、即FM模式;在低溫和高溫下均產(chǎn)生雌性，在中間溫度下產(chǎn)生雄性、即FMF模式。根據(jù)本文結(jié)果，尼羅羅非魚(yú)在低溫 (20℃、28℃)時(shí)雄性比例不明顯增加、在高溫 (36℃)時(shí)雄性率顯著升高，據(jù)此可判定尼羅羅非魚(yú)TSD類(lèi)型為FM模式。

3.2 控溫對(duì)增質(zhì)量率的影響

為了綜合評(píng)價(jià)各處理組合 (溫度+控溫時(shí)段)誘導(dǎo)雄性化的效果，本實(shí)驗(yàn)除了研究雄性率外、還同步研究了相應(yīng)的增質(zhì)量率和存活率。溫度對(duì)增質(zhì)量率的影響方面:從初始體質(zhì)量比較來(lái)看，增質(zhì)量率的排序?yàn)镃tr＞28℃ ＞36℃ ＞20℃。這說(shuō)明恒定水溫并不利于生長(zhǎng)，推測(cè)是由于在恒定水溫環(huán)境中，魚(yú)體的生理效能不能發(fā)揮到最大、機(jī)體調(diào)節(jié)能力也受限所致。

從控溫時(shí)段結(jié)束至60 DPH(控溫狀態(tài)消除、自然水溫生長(zhǎng))這段時(shí)間的絕對(duì)增質(zhì)量率與自然水溫 (26～30℃)對(duì)照組比較來(lái)看，只有當(dāng)控溫時(shí)段為7－14 DPH時(shí)、36℃的絕對(duì)增質(zhì)量率與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，這說(shuō)明短時(shí)間 (7－14 DPH)的恒定高溫 (36℃)處理對(duì)后續(xù)生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，但長(zhǎng)時(shí)間 (7－21 DPH、7－28 DPH)恒定高溫 (36℃)處理對(duì)后續(xù)生長(zhǎng)速度會(huì)有一定影響。因此，在高溫 (36℃)誘導(dǎo)雄性化的處理中，在保證雄性率的前提下，應(yīng)在盡量短的時(shí)間內(nèi)完成。

另外需要說(shuō)明的是，尼羅羅非魚(yú)存在雄性優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的現(xiàn)象。3種控溫時(shí)段 (7－14 DPH、7－21 DPH、7－28 DPH)、36℃下雄性率較高，理論上絕對(duì)增質(zhì)量率應(yīng)比對(duì)照組高，但實(shí)際并非如此，這可能存在兩個(gè)方面的原因:一是由于初始體質(zhì)量不同、生長(zhǎng)率有所差異，初始體質(zhì)量大的增質(zhì)量率要快些;二是在60 DPH前體質(zhì)量還相對(duì)偏小、還不足以體現(xiàn)出雌雄增質(zhì)量速度的差異。

3.3 控溫對(duì)存活率的影響

溫度對(duì)成活率的影響方面:在魚(yú)蝦類(lèi)中只有一些零星的報(bào)道，在幼體中的報(bào)道更少，施兆鴻等［19］指出了鋸緣青蟹幼體成活與溫度的關(guān)系:相對(duì)高溫會(huì)使水中的溶氧含量下降，NH3含量上升，或者高溫導(dǎo)致胚胎發(fā)育不完全、病害增多、代謝加快等，從而導(dǎo)致幼體死亡。本研究中高溫 (36℃)對(duì)成活率沒(méi)有明顯影響、從而保證了控溫誘導(dǎo)雄性化時(shí)的成活率。這應(yīng)該與尼羅羅非魚(yú)對(duì)高溫和氨氮的耐受能力較強(qiáng)有關(guān)。我們之前的研究表明，從1 DPH－35 DPH高溫處理尼羅羅非魚(yú)仔魚(yú)成活率顯著降低［18］。而本實(shí)驗(yàn)是從7 DPH開(kāi)始的，從這兩種結(jié)果的差異，可以推測(cè)高溫引起死亡率升高可能是發(fā)生在個(gè)體發(fā)育早期 (卵黃囊完全吸收以前)，此時(shí)的仔魚(yú)還沒(méi)有轉(zhuǎn)化為外源性營(yíng)養(yǎng)，對(duì)高溫環(huán)境的耐受力較弱。

本研究中，長(zhǎng)時(shí)間 (7－21 DPH、7－28 DPH)的低溫 (20℃)處理能引起死亡率升高，這可能是由于羅非魚(yú)屬溫水性魚(yú)類(lèi)、不能耐受低溫，仔魚(yú)對(duì)低溫的耐受能力更弱，長(zhǎng)時(shí)間低溫使其產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)。

4 結(jié)論

當(dāng)控溫時(shí)段為7－14 DPH、溫度為36℃(±0.5℃)時(shí)。此時(shí)平均雄性率93.85%、最高能達(dá)到96.96 %;存活率與對(duì)照組無(wú)顯著差異;控溫狀態(tài)消除后、在自然水溫條件下的增質(zhì)量率也不受影響。因此綜合比較來(lái)看，控溫誘導(dǎo)尼羅羅非魚(yú)仔魚(yú)雄性化的最優(yōu)處理組合 (溫度+控溫時(shí)段)為(36℃ +7－14 DPH)。

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