AQC柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定寶樂果中的游離氨基酸*

劉 博，韓曉東，張敏婷，徐方方，周 文，焦 紅

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510006;2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510623)

寶樂果 (Borojoa sorbilis Cuter.)是茜草科林果屬植物Borojoa patinoi Cuatrec.和Borojoa sorbilis Cuatrec.的成熟果實(shí)，產(chǎn)于拉丁美洲厄瓜多爾氣候的熱帶雨林，呈棕褐色，直徑達(dá)7～12 cm，質(zhì)量達(dá)700～1000 g，88%以上為果漿，黏性很強(qiáng)，味道酸澀［1］，有特殊果香。寶樂果營(yíng)養(yǎng)豐富，含多糖、植物油、礦物質(zhì)、維生素、稀土元素，蛋白質(zhì)、氨基酸成分也占有一定的比例，特別是人體所必需氨基酸。焦紅等［2］采用質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)寶樂果中有26種游離氨基酸，但并未進(jìn)行定量研究。本文采用東方集團(tuán)提供的寶樂果成熟果實(shí)的果肉，對(duì)其游離氨基酸的構(gòu)成和含量進(jìn)行分析，為寶樂果研究開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

6－氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞胺基－氨基甲酸酯 (AQC)柱前衍生化法是近年來使用最廣泛的氨基酸分析方法，具有簡(jiǎn)單、靈敏而快速的優(yōu)點(diǎn)［3－5］。AQC是一種具有高反應(yīng)活性的雜環(huán)氨基甲酸酯，可與伯胺和仲胺反應(yīng)生成穩(wěn)定的衍生物脲［6］。這種衍生物十分穩(wěn)定，0～4℃環(huán)境下可保存一個(gè)月，常溫條件下可保存一周，且有很強(qiáng)的紫外吸收和熒光吸收。衍生操作簡(jiǎn)單，衍生速度快，30 s即可反應(yīng)完全，且定量準(zhǔn)確，過量的衍生試劑可水解，緩沖溶液使用范圍廣［7－9］。此法應(yīng)用于食品和藥品中氨基酸的含量測(cè)定，取得了很好的效果［7，10］。故本實(shí)驗(yàn)以 AQC為衍生試劑，以柱前衍生化高效液相色譜法對(duì)寶樂果中所含的游離氨基酸進(jìn)行分析和測(cè)定。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng):Agilent Technologies 1200 Series(脫氣機(jī):G13122A;四元泵:G1311A;自動(dòng)進(jìn)樣器:G1329A;檢測(cè)器:G1314B);色譜柱:Phenomenex Luna C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm);離心機(jī):B600A BAIYANG CENTRIFUGE G20;超聲儀:必能信Kleen Sonic 320－D(功率250 W，頻率100 kHz);磁力攪拌器:上海禾汽儀器有限公司85－2B型;津騰隔膜真空泵;pH計(jì):Mettlter Toledo Delta 320;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:Buchi;移液槍:2～20 μL，20～200 μL，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器 (北京)有限公司;無水溶劑純化系統(tǒng):Innovative Technology PS－MD－5;純水儀:18.2 MΩ，Millipore。

1.2 試藥、樣品及緩沖鹽配置

寶樂果:東方集團(tuán)有限公司提供的成熟寶樂果。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品:L－組氨酸 (L－His)、L－天冬氨酸 (L－Asp)、L－異亮氨酸 (L－Ile)、L－亮氨酸 (LLeu)、L－脯氨酸 (L－Pro)、L－賴氨酸 (L－Lys)、L－谷氨酸 (L－Glu)、L－甲硫氨酸 (L－Met)、L－谷氨酰胺 (L－Gln)、L－苯丙氨酸 (L－Phe)、L－蘇氨酸 (LThr)、L－胱氨酸 (L－Cys2)、L－絲氨酸 (L－Ser)、L－色氨酸 (L－Trp)、L－纈氨酸 (L－Val)、L－酪 氨 酸(L－Tyr)、甘氨酸 (L－Gly)、L－丙氨酸 (L－Ala)、γ－氨基丁酸 (γ－GABA)(作為內(nèi)標(biāo)物)，以上樣品均購自上海源聚生物科技公司。

AQC衍生試劑的配制:由實(shí)驗(yàn)室自行合成 (w＞95%)。臨用前取約28.5 mg AQC粉末置于10 mL容量瓶中，以適量無水乙腈溶解并定容至刻度，配成10 mmol/L的AQC溶液，保存于干燥器中。

醋酸銨緩沖液:取約0.77 g(0.01 mol)醋酸銨固體，加水至1 L，以冰醋酸調(diào)pH至5.10。

硼酸鹽緩沖液，溶液 A:取約 7.45 g(0.1 mol)氯化鉀固體和6.20 g(0.1 mol)硼酸，加水至1 L，配成0.1 mol/L的A溶液。溶液B:取約4.00 g(0.1 mol)氫氧化鈉固體，加水至1 L，配成0.1 mol/L的B溶液。取約32.00 mL的B溶液加入100.00 mL的A溶液中，調(diào)節(jié)至pH 8.80。

2 方法

2.1 色譜條件

采用 Phenomenex Luna C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫為35℃;流動(dòng)相A為去離子水，流動(dòng)相 B為乙腈，流動(dòng)相 C為10 mmol/L醋酸銨緩沖液 (pH 5.10)。梯度洗脫，流速為0.8～1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm;進(jìn)樣量為2 μL。按表1條件進(jìn)行梯度洗脫。

2.2 溶液的制備和衍生化反應(yīng)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 單氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液:分別精密稱取以下 19 種氨基酸 (L－His、L－Asp、L－Ile、L－Leu、 L－Pro、 L－Lys、 L－Glu、 L－Met、 L－Gln、 L－Phe、L－Thr、L－Cys2、L－Ser、L－Trp、L－Val、L－Tyr、Gly、L－Ala、γ－GABA)，分別置于 10 mL 容量瓶中，加適量0.1 mol/L鹽酸溶解、定容至10 mL，制成19種濃度均為5 mmol/L的單氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液:分別精密稱取以上18種氨基酸 (除γ－GABA)，置于10 mL容量瓶中，加適量0.1 mol/L鹽酸溶解、定容至10 mL，制成濃度為5 mmol/L的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取成熟寶樂果果肉1.0 g，加入50 mL φ=50%乙醇/水超聲提取30 min，提取2次。以φ=50%乙醇/水洗濾渣，每次3 mL，共3次，濾液和洗液合并，旋干，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，0～4℃保存?zhèn)溆?，即得寶樂果供試品溶液?/p>

2.2.3 空白溶液 取10 μL 0.1 mol/L鹽酸溶液置反應(yīng)管中，即得空白溶液。

2.2.4 衍生化反應(yīng)步驟 ①取待檢測(cè)溶液10 μL，置反應(yīng)管中，加入70 μL硼酸緩沖液，渦旋均勻;②再加入20 μL AQC溶液，渦旋30 s;③55℃恒溫加熱反應(yīng)10 min;④以0.22 μm微孔濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至樣品分析瓶中，即得衍生化待檢測(cè)溶液。

2.3 方法性考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取混合氨基酸對(duì)照品溶液、單氨基酸對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下的方法進(jìn)行氨基酸衍生化反應(yīng)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，進(jìn)樣量為 2 μl。

2.3.2 線性關(guān)系 精密吸取 “2.2.2”項(xiàng)下混合氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量和內(nèi)標(biāo)物γ－氨基丁酸(γ－GABA)適量，分別置10 mL量瓶中，制成濃度分 別 為 0.02，0.075，0.1，0.125，0.25，0.5 mmol/L的稀釋混合氨基酸溶液。按“2.2.4”項(xiàng)下的方法進(jìn)行氨基酸衍生化反應(yīng)。

分別取上述反應(yīng)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為2 μL，得峰面積。分別以各種氨基酸對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)物γ－氨基丁酸(γ－GABA)的峰面積比值y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度x(mmol/L)為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，計(jì)算回歸方程。

2.3.3 檢測(cè)限 將最低濃度 (0.02 mmol/L)的混合氨基酸溶液逐步稀釋后再進(jìn)行衍生化反應(yīng)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，進(jìn)樣量為2 μL，確定最低檢測(cè)限 (信噪比:S/N=3)，得到各種氨基酸的最低檢測(cè)限。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取混合氨基酸對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件平行進(jìn)樣5次，根據(jù)各氨基酸色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物γ－氨基丁酸 (γ－GABA)峰面積的比值，計(jì)算RSD。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0，1.5，4，8，16，24 h進(jìn)樣，根據(jù)各氨基酸色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物γ－GABA峰面積的比值，計(jì)算RSD。

2.4 供試樣品的測(cè)定

2.4.1 含量測(cè)定及重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 平行稱取果肉各5份，每份約1.0 g。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)各種氨基酸的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，計(jì)算各種氨基酸含量和RSD值，以考察方法的重復(fù)性。

2.4.2 加樣回收實(shí)驗(yàn) 分別取已知含量的寶樂果1.0 g，平行5份，分別加入100 μL氨基酸儲(chǔ)備液，分別進(jìn)行提取、衍生化反應(yīng)和色譜分析，計(jì)算各種氨基酸的加樣回收率和RSD。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件洗脫的18種氨基酸基本實(shí)現(xiàn)基線分離，分離結(jié)果見圖1。18種氨基酸在0.02～0.5 mmol/L范圍內(nèi)的峰面積比具有良好的線性關(guān)系;以S/N=3確定最低檢測(cè)限范圍在0.351～1.462 ng。結(jié)果見表 2。精密度試驗(yàn) RSD 在0.20% ～1.40%(n=5)，精密度良好;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD在0.28% ～3.90%(n=5)，穩(wěn)定性良好。

圖1 18種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品AQC衍生化溶液的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of 18 AQC－derivatized amino acid standards

表2 18種氨基酸的線性方程、檢測(cè)限(n=5)Table 2 Regression equations and LOD(n=5)

3.2 供試品測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，寶樂果中檢測(cè)出14種游離氨基酸，其中7種為人體必須氨基酸。各批次樣品中，檢出氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.087～2.680 mg/g，以苯丙氨酸 (Phe)的含量最高，色氨酸 (Trp)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸 (Gly)含量次之，谷氨酰胺(Gln)、組氨酸 (His)、胱氨酸 (Cys2)、蛋氨酸(Met)由于含量低于檢測(cè)限而未能檢出;不同批次的樣品中，各氨基酸的含量存在一定的差異性，其重復(fù)性試驗(yàn)RSD在0.14% ～0.96%(n=5);平均回收率在96.9% ～106.9%，RSD在0.67%～3.07%(n=5)，結(jié)果見表 3。

3.3 供試樣品提取方法的優(yōu)化

為最大限度提取寶樂果中的氨基酸，本實(shí)驗(yàn)做了正交實(shí)驗(yàn)來考察提取因素 (溶劑、溶劑比例、提取時(shí)間和溶劑用量)對(duì)結(jié)果的影響。發(fā)現(xiàn)，采用φ=50%乙醇/水50 mL，超聲提取30 min的樣品中游離氨基酸含量相對(duì)最高。因此，本實(shí)驗(yàn)確定寶樂果的提取條件為以φ=50%乙醇/水50 mL超聲提取30 min。

3.4 氨基酸進(jìn)行柱前衍生化－HPLC分析的注意事項(xiàng)

氨基酸本身無紫外吸收，需衍生化后才能進(jìn)行高效液相色譜分析，因此衍生化反應(yīng)要完全，但是AQC的用量過大，其副產(chǎn)物AMQ會(huì)大大增加。如衍生試劑峰大于衍生空白樣中的AMQ的80%，可能是衍生時(shí)混合不均勻，所以衍生化操作應(yīng)在樣品渦旋狀態(tài)下加入衍生試劑，以確?；旌暇鶆颍?1］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)摸索，我們發(fā)現(xiàn)加入AQC的量若適當(dāng)，其所產(chǎn)生的副產(chǎn)物NHS和AMQ對(duì)氨基酸的分離產(chǎn)生的干擾很小。

表3 供試樣品中14種氨基酸含量和回收率(n=5)Table 3 Contents and recoveries of 14 amino acids of samples(n=5)

氨基酸為兩性物質(zhì)，流動(dòng)相pH對(duì)其分離度影響很大，因此要保證流動(dòng)相D pH值的準(zhǔn)確和穩(wěn)定，數(shù)值精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位［9］。緩沖鹽的濃度過大對(duì)色譜柱有一定的損耗，且容易堵塞流通泵，以不高于10 mmol為宜。流動(dòng)相使用有效期為兩天，過期的流動(dòng)相會(huì)造成各峰的重疊［12］。若使用超過兩天，可加入少量疊氮化鈉EDTA以防止細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)［13］。流動(dòng)相在使用前必須先過濾，除掉雜質(zhì)，再超聲10 min(流動(dòng)相D只需超聲30 s，防酸揮發(fā)，導(dǎo)致pH值變化)，以除去較大氣泡，減少流通泵壓力。為使基線呈水平狀，可加入0.01% 丙酮［12］。

3.5 通路系統(tǒng)的清洗

高效液相色譜系統(tǒng)開啟后要馬上開啟定期清洗操作，采用φ=10%異丙醇清洗管路，防止流動(dòng)相 (含醋酸銨和硼酸鹽)鹽析，以保護(hù)儀器。儀器使用完后需及時(shí)清洗管路及色譜柱，應(yīng)先用高水溶劑長(zhǎng)時(shí)間低流速?zèng)_洗，再用小于φ=50%乙腈/水進(jìn)行梯度清洗，最后用乙腈清洗。

［1］MOSQUERALH， MORAGAG， MARTINEZ－NA－VARRETE N.Effect of maltodextrin on the stability of freeze－dried borojo(Borojoa patinoi Cuatrec.)powder［J］.Journal of Food Engineering，2010，97:72－78.

［2］焦紅，孟平，李丹，等.熱帶水果Borojo全營(yíng)養(yǎng)素分析［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2011，17(8):68－72.

［3］LI W H，HOU M J，CAO Y S.Detemination of 20 free amino acids in asparagus tin by high－performance liquid chromatographic method after pre－column derivatization［J］.Food Anal Methods，2012，5:62－68.

［4］CANCHO－GRANDE B，RODRIGUEZ－COMESANA M，SIMAL－GANDARA J.Simple HPLC determination of colistin in medicated feeds by pre－column derivatization and fluorescence detection［J］.Chromatographic，2001，54:481－484.

［5］ESCARRONE A L V，BITTENCOURT C F，LAPORTA L V.LC－UV method with pre－colunm derivatization for the determination of ciclopirox olamine in raw material and topical solution［J］.Chromatographic，2008，67:967 －971.

［6］WARD M.The Protein Protocols Handbook［M］.UK:Humana Press，1996:461 －465.

［7］HERNANDEZ－ORTE P，IBARZ M J，CACHO J.Amino acid determination in grape juices and wines by HPLC using a modification of 6－aminoquinolyl－N－h(huán)ydroxysuccinimidyl carbamate(AQC)method［J］.Chromatographic，2003，58:29－35.

［8］覃婷婷，白海嬌，黃哲蘇，等.AQC柱前衍生法在氨基酸分析測(cè)定中的應(yīng)用［J］.天津藥學(xué)，2010，22(5):51－53.

［9］MASUDA A，DOHMAE N.Amino acid analysis of subpicomolar amounts or proteins by precolumn fluorescence derivatization with 6－aminoquinolyl－N－h(huán)ydroxysuccinimidyl carbamate［J］.BioScience Trends，2011，5(6):231－238.

［10］柯雪紅，孫維廣，姚江雄，等.夏桑菊顆粒氨基酸類成分指紋圖譜的研究［J］.中成藥，2007，29(6):781.

［11］陳宇，梁蔚陽，薛巧如，等.AccQ－Tag法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液(18AA－V)中17種氨基酸的含量［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，24(2):243－246.

［12］陳鷺穎，黃興宇，劉錫鈞.OPA－FMOC聯(lián)用柱前衍生法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液中氨基酸的含量［J］.福州總醫(yī)院學(xué)報(bào)，1990，6(4):2323－2327.

［13］徐赤，顧謙群，付余強(qiáng).AccQ－Tag法測(cè)定毛蚶抗貧血口服液中的氨基酸含量［J］.青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，32(3):380－384.