基因缺失豬繁殖與呼吸綜合征病毒河北株HB－Xt1的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性

趙駐軍，宋勤葉，李 曼

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原生物學(xué)華北區(qū)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，河北 保定071000）

近年來(lái)河北省高致病性PRRS病例屢屢發(fā)生，為了弄清本地區(qū)流行的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）毒株的分子特征和生物學(xué)特性，本實(shí)驗(yàn)室從河北省某豬場(chǎng)疑似PRRS死亡仔豬的脾臟和淋巴結(jié)混合物內(nèi)分離到的1株高致病性PRRSV，明確了其體外培養(yǎng)特性，以便為進(jìn)一步研究該毒株的致病性及相應(yīng)的弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 MARC－145細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs Mixture、Taq DNA聚合酶等，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；鼠抗PRRSV E蛋白多克隆抗體和鼠抗PRRSV陰性血清，由本實(shí)驗(yàn)制備；兔抗鼠IgG酶標(biāo)二抗，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集及處理 無(wú)菌采集疑似PRRS病豬的脾和淋巴結(jié)，研磨后，用PBS（0.01mol／L pH 值7.2）制成1∶3組織懸液，反復(fù)凍融3次后，8 000r／min離心10min，取上清液加入1 000IU（μg）／mL的青霉素、鏈霉素，作用過(guò)夜，備用。

1.3 病毒的分離培養(yǎng) 取制備好的組織懸液過(guò)濾除菌后，接種于生長(zhǎng)良好的 MARC－145細(xì)胞單層上，37℃5%CO2條件下吸附1h，加入含2%小牛血清的細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)72h，收獲培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次。取凍融液1mL盲傳5代，收獲病毒（分離病毒命名為 HB－Xt1），－20℃保存待檢。在培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。

1.4 分離毒株的IPMA檢測(cè) 取收獲的F3代分離毒接于MARC－145細(xì)胞，培養(yǎng)50～60h時(shí)，應(yīng)用免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)檢測(cè)［5］。DAB顯色后，觀察細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)性信號(hào)（棕褐色沉淀物）。同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照和陰性血清對(duì)照。

1.5 分離毒株ORF5全基因和Nsp2部分基因序列的測(cè)定與分析用引物P1－P2（P1：5′－AGCCTGTCTTTTTGCCAT－3′，P2：5′－CTTTTCTGGAGCCGTGCTATC－3′）、P3－P4（P3：5′－CCTCCGTGGTGCAACAAATCTTG－3′，P4：5′－CGATGATGGCTTGAGCTGAGTAT －3′）分 別 擴(kuò) 增 PRRSV 的 ORF5（682bp）和Nsp2基因片段（1 064bp）。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min；94℃1min，56～59℃1min，72℃1min，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10min。取PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對(duì)克隆的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定，并用生物學(xué)軟件MEGA5.05進(jìn)行分析。

1.6 不同代次病毒的TCID50測(cè)定 將分離病毒于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)72h，收獲病毒，繼續(xù)傳代至第5代（F5）。通過(guò)IPMA測(cè)定F1～F5代病毒的TCID50。

1.7 病毒的增殖動(dòng)態(tài)檢測(cè) 將分離的F5代病毒，接種到 MARC－145細(xì)胞上，于37℃5%CO2下培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h時(shí)收獲病毒，通過(guò)IPMA分別測(cè)定不同時(shí)間收獲病毒的TCID50，以分析病毒在細(xì)胞上的增殖動(dòng)態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 分離病毒在 MARC－145細(xì)胞中增殖可導(dǎo)致CPE 將經(jīng)處理的脾和淋巴結(jié)勻漿接種到MARC－145細(xì)胞單層培養(yǎng)至60h時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)變暗、圓縮、聚集等細(xì)胞病變效應(yīng)，至72h時(shí)可見(jiàn)部分細(xì)胞崩解、脫落現(xiàn)象（見(jiàn)中插彩版圖1）。F3代后CPE穩(wěn)定在60h左右出現(xiàn)。

2.2 分離毒株能夠與抗PRRSV陽(yáng)性血清特異性結(jié)合 F3代分離病毒接種到MARC－145細(xì)胞培養(yǎng)50～60h時(shí)，應(yīng)用IPMA檢測(cè)，可見(jiàn)細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)特異性棕褐色沉淀物，而對(duì)照細(xì)胞漿內(nèi)無(wú)棕褐色沉淀物形成。該結(jié)果表明，分離病毒能夠與抗PRRSV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)有PRRSV增殖（見(jiàn)中插彩版圖2）。

2.3 分離毒株ORF5序列和非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2部分基因序列的分析 應(yīng)用生物學(xué)軟件MEGA 5.05和DNAMAN序列分析表明，分離毒株的ORF5序列（GenBank收錄號(hào)：EU008759）與2006年后國(guó)內(nèi)流行的高致病性PRRSV毒株JXA1、HuB2、HBTsh1等的相似性在99.8%以上；與2006年前國(guó)內(nèi)的PRRSV分離株CH－1a的相似性為95.36%，而與國(guó)內(nèi)BJ－4株和美國(guó)分離株VR－2332的相似性較低，分別為88.39%和89.22%。

對(duì)Nsp2部分基因序列的分析結(jié)果同樣顯示，分離株與2006年后國(guó)內(nèi)流行的高致病性PRRSV分離株Nsp2基因相應(yīng)序列的相似性最高（約99.7%），也存在兩處缺失，即缺失3bp和87bp，共計(jì)缺失30aa；與之前國(guó)內(nèi)流行的代表毒株CH－1a、BJ－4以及美洲型代表株VR－2332的相似性較低（分別為84.3%、72.4%和72.4%）。

對(duì)分離毒株ORF5序列和Nsp2基因部分序列的遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果均顯示，分離株與美洲型毒株同處于一個(gè)大分支，與2006年后國(guó)內(nèi)分離的高致病性PRRSV Nsp2基因缺失毒株的遺傳關(guān)系最近，與早期（2001年）分離株CH－1a和BJ－4的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。與BJ－4株相比，分離株與CH－1a的遺傳關(guān)系較近（圖略）。

2.4 不同代次分離毒株的TCID50測(cè)定 F1～F5代分離毒株在MARC－145細(xì)胞上培養(yǎng)72h時(shí)的毒價(jià)分 別為104.95±0.05、105.45±0.06、105.69±0.04、105.90±0.04和106.31±0.03。可見(jiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，TCID50逐漸上升，F(xiàn)4代后，TCID50穩(wěn)定在106.0TCID50／mL左右。

2.5 分離毒株的增殖動(dòng)態(tài) 分離毒株（F5代）在MARC－145細(xì)胞上培養(yǎng)72h時(shí)，病毒滴度達(dá)到最高水平，為106.12±0.025／mL，隨后逐漸下降，至120h時(shí)病毒滴度降低為105.18±0.025／mL（圖3）。

圖3 分離株 HB－Xt1（F5代）在 MARC－145細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)

3 討論

PRRSV具有較嚴(yán)格的宿主細(xì)胞特異性，豬肺泡巨噬細(xì)胞是分離培養(yǎng)本病毒的最佳細(xì)胞，其次PRRSV還可在恒河猴腎細(xì)胞系MA－104及其衍生細(xì)胞系（MARC－145、CL－2621、CRL－1171、HS.2H）中增殖，其中對(duì) MARC－145細(xì)胞具有高度敏感性［6］。由于PAM制備不方便，容易污染其他病原微生物，因此本試驗(yàn)中選擇MARC－145細(xì)胞用于病毒分離。分離毒株HB－Xt1能夠在MARC－145細(xì)胞中增殖，并導(dǎo)致細(xì)胞變暗、圓縮、聚集、崩解、脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)，此與PRRSV的培養(yǎng)特性一致［6］。通過(guò)IPMA證明，分離病毒能夠與鼠抗PRRSV E蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，表明分離病毒HB－Xt1為PRRSV。進(jìn)一步觀察IPMA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)（病毒感染細(xì)胞）呈簇狀分布（見(jiàn)中插彩版圖2A），說(shuō)明病毒是通過(guò)細(xì)胞間傳播方式感染相鄰MARC－145細(xì)胞的，此現(xiàn)象與Cafruny等（2006）［7］的報(bào)道一致。

已知無(wú)論歐洲型還是美洲型PRRSV不同分離株的核苷酸序列均存在著廣泛而明顯的變異，并且變異速率較快［8－9］。在PRRSV基因組內(nèi)以病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp）編碼區(qū)ORF1a和結(jié)構(gòu)蛋白E編碼區(qū)（ORF5）的變異較大，ORF1a中的變異主要集中在Nsp1β和Nsp2編碼區(qū)［8］。2006年以來(lái)，國(guó)內(nèi)流行的高致病性PRRS即是由Nsp2編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生不連續(xù)2處缺失的高致病性毒株引起的［4］。本試驗(yàn)中HB－Xt1分離株的ORF5和Nsp2蛋白編碼序列與2006年前國(guó)內(nèi)流行的經(jīng)典PRRSV CH－1a、BJ－4以及美洲型PRRSV代表株VR－2332株的相似性較低，而與2006年后國(guó)內(nèi)流行的高致病性PRRSV的遺傳關(guān)系最近，并且Nsp2蛋白編碼序列內(nèi)也存在兩處不連續(xù)的缺失，故推測(cè)PRRSV HB－Xt1株可能為一株高致病性美洲型PRRSV。關(guān)于該分離株對(duì)豬的致病性需要通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步證明。

PRRSV不同毒株在相同細(xì)胞系上增殖時(shí)的病毒滴度 （TCID50）不盡相同。一般 PRRSV 在MARC－145、CL2621等細(xì)胞系上的 TCID50為105～106［6］。本試驗(yàn)中顯示隨著傳代次數(shù)的增加HB－Xt1分離株在MARC－145細(xì)胞中增殖時(shí)的TCID50逐漸升高，傳至F4～F5代時(shí)達(dá)到106.0TCID50／mL左右，CPE出現(xiàn)時(shí)間也逐漸一致，并且發(fā)現(xiàn)接種病毒后72h時(shí)，TCID50達(dá)到最高值，隨后逐漸降低。此增殖動(dòng)態(tài)與PRRSV感染MARC－145時(shí)依賴細(xì)胞間傳播的方式有關(guān)［7］。因?yàn)镻RRSV感染初期（感染后20～22h）病毒僅在少量細(xì)胞內(nèi)增殖，隨后病毒通過(guò)細(xì)胞間傳播方式使多數(shù)細(xì)胞感染，病毒增殖量逐漸增加進(jìn)入對(duì)數(shù)感染期（感染后2～3d），所以在一定時(shí)間內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒滴度逐漸上升。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，由于受到CPE、細(xì)胞自身的生長(zhǎng)周期以及維持液pH值變化等因素的影響，病毒可能死亡，從而導(dǎo)致72h后病毒滴度明顯下降。故選擇 MARC－145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV HB－Xt1株時(shí)，以感染后72h為收獲病毒的最佳時(shí)間。

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