易 玲 邱榮元 王松柏 劉崇梅 馮喜華 萬焱鑫 伍小瓊 何生松
原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第五大常見惡性腫瘤,在癌癥相關(guān)死亡原因中排名第三。盡管外科手術(shù)及肝移植治療取得了很大進展,但肝癌的預(yù)后仍不樂觀。
P21具有廣泛的細胞周期抑制活性,理論上其與肝癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān),然而國內(nèi)外對其預(yù)測價值意見很不一致。目前認識到P21具有不同的功能狀態(tài),比如抑制細胞增殖與促進細胞增殖,抑制細胞凋亡與促進細胞凋亡。而P21的功能狀態(tài)與亞細胞定位密切相關(guān)。
本課題組前期研究中[1-3],初步證實當P21定位于細胞質(zhì),胞質(zhì)型P21促進HepG2細胞增殖、促進細胞周期運行、增強其抗凋亡能力。作為前期項目的延伸,本研究采用免疫組織化學的方法,檢測原發(fā)性肝細胞肝癌組織中P21表達情況及其亞細胞定位,并探討與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
收集2007年2月至2012年9月岳陽市第二人民醫(yī)院、華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院收治的115例肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌病例資料及手術(shù)切除于病理科存檔的石蠟包埋標本,其中包括同一病例的肝癌組織、癌旁組織、肝硬化組織。115例中,男性81例,女性34例;年齡16~71歲,平均年齡47歲,中位年齡 48歲;腫瘤直徑平均 5.6 cm(1.5~12 cm)。根據(jù) Edmondson-Steiner標準分級:Ⅰ-Ⅱ級 48例(41.74%)Ⅲ-Ⅳ級67例(58.26%)。HBsAg陽性98例(85.21%)。
表1 P21陽性表達與HCC臨床病理特征的關(guān)系
鼠抗 P21W AF/CIP1單克隆抗體(Neo Markers);SP試劑盒、DAB顯色劑(北京中杉公司)。
采用SP法,嚴格按照試劑盒操作說明進行P21免疫組化染色,采用檸檬酸高溫高壓法進行抗原修復(fù),抗體稀釋度為1:200,DBA顯色,蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片。以PBS和正常血清分別代替一抗與二抗作陰性對照。陽性細胞計數(shù)標準如下:每個位點隨機選取3個高倍鏡視野,平均每高倍鏡陽性細胞<5% 為“-”,5%~25% 為“+”,26%~50% 為“++”,>50% 為“+++”。P21W AF/CIP 1陽性染色為胞質(zhì)型或核型,淡黃色、棕黃色或棕褐色,呈顆粒狀或團塊狀。
所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件包作統(tǒng)計處理。各組陽性表達率差異的比較及與臨床參數(shù)之間關(guān)系采用卡方檢驗;單因素相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)法。多組之間的兩兩比較采用秩和檢驗法,求Hc值,推斷P值范圍。
肝硬化組織中P21陽性表達率為10.43%(12/115),原發(fā)性肝細胞肝癌組織中陽性率為35.65%(41/115),癌旁組織為38.26%(44/115),肝癌與癌旁組織相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),肝癌與肝硬化組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),癌旁與肝硬化組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
胞質(zhì)型P21陽性率在癌旁組織中為6.82%(3/44),在肝硬化組織中為8.33%(1/12),在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中為75.61%(31/41)。肝癌與癌旁組織及肝硬化組相比,胞質(zhì)型P21陽性表達率的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);而癌旁與肝硬化組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
胞質(zhì)型P21在肝癌組織中Ⅰ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級的陽性率分別為 42.89%(6/14),92.59%(25/27),胞質(zhì)P21的陽性表達與腫瘤細胞分化程度明顯負相關(guān)(γ=-0.42,P<0.01),胞質(zhì)型 P21 在肝癌組織中無轉(zhuǎn)移及有轉(zhuǎn)移的患者中陽性率分別為73.07%(12/15),80.00%(19/26),胞質(zhì) P21與腫瘤轉(zhuǎn)移正相關(guān)(γ=0.27,P<0.05),而與年齡、HBSAg、腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05)。見表1。
P21是el-Deiry等于1993年發(fā)現(xiàn)的1種能夠被p53轉(zhuǎn)錄激活的基因,編碼分子量為21 kDa的蛋白,因此命名為P21[4]。P21具有眾多蛋白質(zhì)結(jié)合位點,其中某些部位相互重疊,如P21可與細胞周期素(cyclin)、細胞周期素依賴的蛋白酶(CDK)、增殖細胞核抗原(PCNA)、切冬酶原3(Procaspase 3)、MAPK家族分子、鈣調(diào)蛋白等相互作用,此外還有核定位信號(nuclear locational signal,NLS)、核輸出信號(nuclear export signal,NES),從而影響其亞細胞定位[5]。
P21蛋白最初因其細胞周期抑制活性而為人們所熟知,因而人們將其歸屬為抑癌基因的范疇。目前關(guān)于P21功能的研究,認識到P21涉及到細胞的生長、分化、凋亡、老化。并且,P21具有不同的功能狀態(tài),比如抑制細胞增殖與促進細胞增殖,抑制細胞凋亡與促進細胞凋亡[6-7]。而P21的功能狀態(tài)與某些位點的磷酸化、亞細胞定位密切相關(guān)[8]。
P21的抑癌功能與其核定位密切相關(guān),而胞核P21的促進細胞生長及抗凋亡能力在許多細胞的研究中得到證實,如在急性單核細胞性白血?。?]、人乳腺癌[10]、神經(jīng)腫瘤性疾患[11]。
當P21定位于細胞質(zhì),可與細胞凋亡信號分子相結(jié)合,如與Procaspase 3結(jié)合,阻止Fas介導(dǎo)的凋亡途徑[12-13],并且通過抑制促凋亡激酶(apoptosis signalregulating kinase 1,Ask1)而使抗凋亡效應(yīng)進一步放大[14]。Tanaka等發(fā)現(xiàn)[15],胞質(zhì) P21 蛋白可與 Rho 激酶形成復(fù)合體并抑制其激酶活性,導(dǎo)致肌動蛋白應(yīng)力纖維丟失,促進細胞外生性生長。在某些腫瘤性疾患中,也發(fā)現(xiàn)胞核P21蛋白表達與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,其機制可能為胞核P21抑制Rho激酶活性,肌動蛋白應(yīng)力纖維丟失,細胞活動性增強,最終導(dǎo)致腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[11]。
目前關(guān)于P21的亞細胞定位與肝癌的關(guān)系,研究尚不多見,而關(guān)于P21與肝癌關(guān)系的報道極不一致,在肝癌組織中,P21的表達意義也未取得一致結(jié)論。
為達到上述研究目的,我們曾采用基因定點誘變的方法[1-3],構(gòu)建了核定位信號突變的P21真核表達載體,轉(zhuǎn)染HepG2細胞,觀察轉(zhuǎn)染的HepG2細胞周期及凋亡率的改變,進一步了解P21亞細胞定位與其功能活性的關(guān)系。
我們通過觀察肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的原發(fā)性肝細胞癌患者,其肝癌組織、癌旁組織、肝硬化組織中P21的表達情況,亞細胞定位分布,結(jié)果顯示 HCC與癌旁肝組織P21的表達無統(tǒng)計學意義,但通過亞細胞定位的分析表明,HCC主要表達在細胞質(zhì),其比例可達到75.61%,而癌旁肝組織胞質(zhì)表達比例為6.82%。進一步根據(jù)肝癌組織的腫瘤細胞分化程度及腫瘤轉(zhuǎn)移情況進行相關(guān)性分析,胞質(zhì)P21的陽性表達與腫瘤細胞分化程度明顯負相關(guān),胞質(zhì)型P21的陽性表達與腫瘤轉(zhuǎn)移正相關(guān)。
本組研究表明,在肝硬化組織中,由于炎癥和纖維化影響,P21表達上調(diào),但主要定位于細胞核,其表達率與炎癥及纖維化程度密切相關(guān)。而在肝癌組織,P21也可見表達上調(diào),但主要定位于細胞質(zhì),而且胞質(zhì)表達的比例與腫瘤分化程度、腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此,細胞質(zhì)P21的高表達,可能有助于原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展。雖然P21具有廣泛的細胞周期抑制活性,但既往以P21為靶點的抗腫瘤治療,并沒有取得令人鼓舞的臨床效果,考慮可能與忽視了P21蛋白的功能狀態(tài)與其亞細胞定位密切相關(guān),因此,從亞細胞定位角度,調(diào)整P21的抗腫瘤治療策略,也許是條可行的途徑。
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