SFTPB、TACSTD1、PVA基因聯(lián)合檢測非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的研究

陳文學(xué) 方選妹 黎文婷 齊淑軼 鄒學(xué)森

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占80%。肺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是患者高死亡率的主要原因，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NSCLC轉(zhuǎn)移的主要途徑。腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1(tumor-associated calcium signal transducer 1，TACSTD1)也稱為上皮細(xì)胞粘附分子，在上皮癌變過程中發(fā)揮著作用，同時(shí)也被用于檢測各種腫瘤的微轉(zhuǎn)移［1-2］。尋常型天皰瘡抗原(pemphigus vulgarisantigen，PVA)又稱為橋粒芯糖蛋白3，是自身免疫性疾病天皰瘡的血清學(xué)抗原，在頭頸腫瘤中研究較多，近年來有報(bào)道其用于NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測。表面活性蛋白B(surfactant protein B，SFTPB)是Ⅱ型肺泡細(xì)胞分泌的表面活性分子，同時(shí)也是肺腺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢測指標(biāo)之一。本研究通過熒光定量PCR技術(shù)檢測NSCLC癌組織、組織學(xué)陽性的淋巴結(jié)及肺良性病變的淋巴結(jié)中的SFTPB、TACSTD1、PVA mRNA表達(dá)水平，研究其用于NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院2009年2月至2011年12月的40例非小細(xì)胞肺癌及淋巴結(jié)標(biāo)本，其中男性28例，女性12例，平均年齡57.4歲。所有病例均為初治，行肺癌根治術(shù)加淋巴結(jié)清掃術(shù)，均有組織病理診斷證實(shí)。腺癌11例，鱗癌25例，其它類型4例(大細(xì)胞型肺癌3例，大細(xì)胞和小細(xì)胞混合型肺癌1例)。臨床分期:Ⅰ期7例，Ⅱ期13例，Ⅲ期9例，Ⅳ期12例。取手術(shù)治療20例非肺癌患者淋巴結(jié)20枚作為陰性對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 手術(shù)后標(biāo)本30 min內(nèi)取材，小心去除腫瘤和淋巴結(jié)上的脂肪組織和血凝塊，用無RNA酶的水沖洗，去除可能污染的腫瘤細(xì)胞，每個(gè)淋巴結(jié)均分2份，一份送病理科進(jìn)行常規(guī)病理檢查，一份存放－80℃保存。

1.2.2 總 RNA提取、cDNA合成及 PCR擴(kuò)增 總RNA提取使用RNA提取試劑盒(qiagen)，按說明書步驟操作，逆轉(zhuǎn)錄熒光定量檢測使用試劑盒(takara)，引物在上海生物工程有限公司合成。為了保證逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的可靠性，設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)跨內(nèi)含子，每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物均在內(nèi)參基因擴(kuò)增出后再進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照管。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用ΔCT法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的分析［3］，ROC曲線分析腫瘤標(biāo)志物敏感性、特異性，所有的統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS10.0計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 SFTPB、TACSTD1、PVA 基因的表達(dá)情況

20例原發(fā)性NSCLC肺癌組織，20例組織學(xué)陽性淋巴結(jié)，20例肺良性疾病淋巴結(jié)的SFTPB、TACSTD1、PVA基因相對(duì)表達(dá)量的分析見圖1。圖中數(shù)據(jù)顯示腫瘤組織與組織學(xué)陽性的淋巴結(jié)的基因表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與肺良性疾病淋巴結(jié)的基因表達(dá)水平差異顯著(P＜0.05)。將良性淋巴結(jié)的最高表達(dá)值設(shè)為cutoff值(100.0%的特異性)，組織學(xué)陽性的淋巴結(jié)的敏感性分別為 SFTPB(45.7%)、TACSTD1(100.0%)、PVA(75.4%)。TACSTD1基因在陽性淋巴結(jié)與良性淋巴結(jié)之間的最小差異倍數(shù)為6.2倍。

圖1 SFTPB、TACSTD1、PVA基因在NSCLC肺癌組織及淋巴結(jié)中表達(dá)情況

2.2 SFTPB、TACSTD1、PVA 基因在不同的組織學(xué)類型中的敏感性(表1)

NSCLC主要有3種不同的組織學(xué)類型，即腺癌、鱗癌、大細(xì)胞肺癌。在100.0%特異性時(shí)3種腫瘤標(biāo)志物在不同的組織學(xué)類型中的敏感性各不相同，PVA對(duì)鱗癌的敏感性達(dá)到100.0%，SFTPB對(duì)腺癌的診斷敏感性達(dá)到83.2%，TACSTD1對(duì)鱗癌腺癌診斷的敏感性均為100.0%。

表1 SFTPB、TACSTD1、PVA基因在不同組織學(xué)類型中的敏感性

3 討論

肺癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，而肺癌的5年生存率沒有明顯的提高，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行了完全性切除術(shù)的Ⅰ期NSCLC患者總的5年生存率60%～70%［4］，患者多死于肺癌的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。因此肺癌的微轉(zhuǎn)移檢測對(duì)于腫瘤切除后分期、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的判斷具有重大意義。

目前判斷肺癌是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移常用手段是病理檢查，但是對(duì)于NSCLC的N分期的常規(guī)病理檢查的準(zhǔn)確性較低。有些腫瘤患者分期低，無明顯轉(zhuǎn)移證據(jù)，但在行癌根治術(shù)后卻早期死于癌轉(zhuǎn)移。這說明患者術(shù)前已存在用常規(guī)組織病理學(xué)方法不能檢出的癌細(xì)胞播散或隱性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這些微轉(zhuǎn)移灶和循環(huán)癌細(xì)胞往往是腫瘤出現(xiàn)顯性轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因。因此對(duì)常規(guī)病理檢查陰性的淋巴結(jié)用免疫組化或分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果陽性則認(rèn)為淋巴結(jié)有微轉(zhuǎn)移。相對(duì)于免疫組化，逆轉(zhuǎn)錄PCR具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):①檢測的敏感性高，免疫組化的敏感性僅能達(dá)到105［5］，而PCR 可達(dá)到106，甚至107［6］，較免疫組化高了 1～2 個(gè)數(shù)量級(jí);②PCR為定性檢查，只要為陽性結(jié)果就能明確腫瘤細(xì)胞的存在;③檢測指標(biāo)客觀，主觀因素影響小，而免疫組化需要根據(jù)顏色、百分比等判定結(jié)果，主觀因素影響大。

Salerno等［7］應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測MUC1基因，其預(yù)測NSCLC患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的敏感性為80%，冼磊等［8］對(duì)31例NSCLC患者病理檢查陽性淋巴結(jié)檢測MAGE基因1-4，至少1種表達(dá)陽性的敏感性達(dá)到87.1%。本研究通過熒光定量PCR技術(shù)檢測NSCLC癌組織、組織學(xué)陽性的淋巴結(jié)及肺良性病變的淋巴結(jié)SFTPB、TACSTD1、PVA mRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)肺癌組織與組織學(xué)陽性的淋巴結(jié)表達(dá)水平相近，與肺良性病變淋巴結(jié)的表達(dá)水平有顯著性差異。TACSTD1對(duì)診斷肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有較高的敏感性和特異性，可以作為獨(dú)立的診斷指標(biāo)。在組織學(xué)類型分類診斷中PVA對(duì)診斷鱗癌有較高的敏感性(100.0%)，SFTPB對(duì)診斷腺癌有較高的敏感性(83.2%)。因此SFTPB、TACSTD1、PVA基因聯(lián)合檢測可以作為肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)指標(biāo)。

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