急性髓系白血病患者SALL4基因的甲基化改變及其臨床意義

焦夕琴，陳芹，林江*，楊靜，陳星星，湯琴，錢(qián)震，馬吉春

(1.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇金壇213200;2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江212002;3.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇鎮(zhèn)江212002;4.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院血液科，江蘇金壇213200)

婆羅雙樹(shù)樣基因4(Sal-like 4，SALL4)是果蠅婆羅雙樹(shù)基因spalt的同源基因SALL家族成員，編碼蛋白是1個(gè)含有8個(gè)鋅指基序的轉(zhuǎn)錄因子，是維持胚胎干細(xì)胞多潛能分化和自我更新及增強(qiáng)造血干細(xì)胞自我更新的重要調(diào)控基因［1－2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SALL4基因在造血系統(tǒng)腫瘤［急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性髓系白血病、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。?、生殖細(xì)胞腫瘤和肝樣胃癌中表達(dá)增高，可能與這些疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［3－7］。但SALL4基因高表達(dá)的機(jī)制至今還未清楚。鑒于DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的可能調(diào)控作用，并且罕見(jiàn)AML患者中SALL4基因啟動(dòng)子的甲基化狀況報(bào)道，我們建立了甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)技術(shù)對(duì)AML患者SALL4基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)并評(píng)價(jià)其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例

45例初診原發(fā)AML患者，其中男29例，女16例，年齡15～86歲(中位年齡56歲)，所有患者依據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織AML分型標(biāo)準(zhǔn)［8］進(jìn)行診斷、分型，均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、染色體和(或)融合基因檢測(cè)證實(shí)。其中AML伴t(8;21)4例、AML伴t(15;17)9例、AML不成熟型7例、AML成熟型9例、急性粒-單核細(xì)胞白血病13例、急性原始單核細(xì)胞白血病和急性單核細(xì)胞白血病2例、急性紅白血病1例。另以20例缺鐵性貧血患者的骨髓mRNA和基因組DNA作為對(duì)照。

1.2 細(xì)胞系

5 種人白血病細(xì)胞株(HL60、HEL、NB4、THP1和U937)以1×106/mL的密度置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。于指數(shù)生長(zhǎng)期收獲細(xì)胞提取總RNA和基因組DNA。

1.3 主要試劑和儀器

參見(jiàn)文獻(xiàn)［9］。

1.4 骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cell，BMNC)分離和基因組DNA制備

全部受試者于骨髓穿刺時(shí)取骨髓10 mL，肝素抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離BMNC。基因組DNA提取按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，經(jīng)紫外分光光度儀定量后置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 DNA亞硫酸氫鹽修飾

每例取DNA標(biāo)本1 μg，按DNA甲基化修飾試劑盒操作步驟進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾處理，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及SALL4表達(dá)檢測(cè)

總RNA提取方法、反轉(zhuǎn)錄體系、反應(yīng)條件和檢測(cè)SALL4表達(dá)的RQ-PCR引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見(jiàn)文獻(xiàn)［6］。

1.7 SALL4基因啟動(dòng)子MSP檢測(cè)

SALL4基因甲基化(M)上游引物:5'-CGTATTTTCGGGTTTGTCGC-3'，下 游 引 物:5'-TTTCTACCCGAACTACGCCG-3';未甲基化(U)上游引物:5'-TTTGTATTTTTGGGTTTGTTGT-3'，下游引物:5'-CTTTTCTACCCAAACTACACCA-3'。熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括10 ×PCR 緩沖液、2.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTP、上下游引物各 0.4 μmol/L、1 U熱啟動(dòng)Taq DNA酶及修飾后的樣本DNA 2 μL。MSP反應(yīng)條件經(jīng)梯度PCR儀優(yōu)化，為95℃預(yù)變性5 min，然后94℃ 30 s。退火溫度:甲基化為63℃ 30 s、未甲基化為59℃ 30 s，然后72℃延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。未甲基化和甲基化陽(yáng)性對(duì)照分別為經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的正常人胎盤(pán)DNA和亞硫酸氫鹽修飾的人白血病K562細(xì)胞株DNA，去離子水作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上采用100 V電壓電泳1 h，在Gene Genius凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。

1.8 MSP特異性、敏感性及重復(fù)性檢測(cè)

K562細(xì)胞和正常人胎盤(pán)DNA分別經(jīng)測(cè)序后鑒定為SALL4完全甲基化和完全未甲基化。應(yīng)用MSP甲基化和未甲基化反應(yīng)體系分別對(duì)硫化和未硫化的K562細(xì)胞DNA標(biāo)本、胎盤(pán)DNA標(biāo)本及雙蒸水進(jìn)行檢測(cè)，確定MSP特異性。取80 ng經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的正常人胎盤(pán)DNA，應(yīng)用經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的K562細(xì)胞DNA進(jìn)行梯度稀釋后行未甲基化MSP檢測(cè)，即未甲基化陽(yáng)性對(duì)照經(jīng)甲基化陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行梯度稀釋以確定未甲基化MSP方法的敏感性。同時(shí)對(duì)1例正常人胎盤(pán)DNA標(biāo)本進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾后分裝，將其在同一批次MSP未甲基化檢測(cè)中重復(fù)3次，2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照;將剩余的陽(yáng)性DNA置于－20℃凍存，每3天進(jìn)行一次未甲基化檢測(cè)，2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照，比較1個(gè)月內(nèi)條帶亮度是否有明顯變化。

1.9 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序

用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將其克隆入pMD?19T克隆載體，對(duì)感受態(tài)大腸埃希菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，將PCR擴(kuò)增為陽(yáng)性結(jié)果的甲基化和未甲基化產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.10 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查

將患者初診時(shí)采集的骨髓細(xì)胞采用直接法和24 h短期培養(yǎng)法制備染色體標(biāo)本，然后進(jìn)行R顯帶處理。按《人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN)》進(jìn)行核型分析。根據(jù)患者預(yù)后情況將染色體分為3組:低危組［t(15;17)、t(8;21)、t(16;16)等］、中危組［正常核型、t(9;11)、9q－、11q－、－Y、+21、+8等］、高危組［復(fù)雜核型、11q23重排、t(9;22)、5q－、－5、－7、7q－等］［10］。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)MSP結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。分類(lèi)變量之間差異的比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法;連續(xù)性變量之間差異分析采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。所有分析均設(shè)定P值為雙側(cè)分布，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSP 測(cè)序結(jié)果

SALL4甲基化和未甲基化陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。甲基化產(chǎn)物中所有胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸(CpG)中的胞嘧啶保持不變，而CpG以外的胞嘧啶均轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?未甲基化產(chǎn)物中的胞嘧啶全部轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぁ?/p>

圖11 例AML患者SALL4基因甲基化特異性PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

2.2 MSP特異性、敏感性及重復(fù)性

硫化修飾后的K562細(xì)胞DNA顯示為甲基化條帶，而無(wú)未甲基化條帶;硫化后的胎盤(pán)DNA顯示未甲基化條帶，而無(wú)甲基化條帶;未硫化的K562細(xì)胞DNA和胎盤(pán)DNA及雙蒸水甲基化和未甲基化結(jié)果均為陰性，說(shuō)明我們建立的MSP方法具有良好的特異性。未甲基化陽(yáng)性對(duì)照用甲基化陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行梯度稀釋后，SALL4未甲基化檢測(cè)的最大靈敏度達(dá)1∶50(2%)。見(jiàn)圖2。同一批次MSP未甲基化檢測(cè)中3次結(jié)果及每3天對(duì)凍存標(biāo)本進(jìn)行一次未甲基化檢測(cè)的重復(fù)性良好，1個(gè)月內(nèi)條帶亮度無(wú)明顯變化。

圖2 SALL4啟動(dòng)子未甲基化陽(yáng)性模板倍比稀釋結(jié)果

2.3 AML患者SALL4基因低甲基化頻率

5種白血病細(xì)胞株 HL60、HEL、NB4、THP1 和U937均呈不同程度的SALL4低甲基化，其MSP結(jié)果見(jiàn)圖3。典型的患者標(biāo)本MSP檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 5種白血病細(xì)胞株甲基化特異性PCR產(chǎn)物

圖4 AML患者M(jìn)SP產(chǎn)物電泳結(jié)果

20例缺鐵性貧血標(biāo)本均為甲基化MSP產(chǎn)物陽(yáng)性、低甲基化MSP產(chǎn)物陰性，低甲基化陽(yáng)性率為0%(0/20);45例AML標(biāo)本均為甲基化MSP產(chǎn)物陽(yáng)性，其中9例呈低甲基化產(chǎn)物陽(yáng)性，低甲基化陽(yáng)性率為20.0%(9/45)，與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析揭示SALL4基因低甲基化改變與患者的年齡、性別、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)等結(jié)果均無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)，但與患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著相關(guān)，低甲基化患者的白細(xì)胞水平明顯高于甲基化患者(P=0.027)。見(jiàn)表1。

2.4 AML患者中SALL4低甲基化與SALL4表達(dá)的相關(guān)性

我們檢測(cè)了23例AML患者的mRNA SALL4表達(dá)水平，SALL4表達(dá)水平和SALL4低甲基化明顯相關(guān)，低甲基化患者(3例)的SALL4表達(dá)水平明顯高于甲基化患者(20例，P＜0.05，表1)。5種白血病細(xì)胞株均呈SALL4陽(yáng)性表達(dá)［6］，與本研究檢測(cè)的細(xì)胞株SALL4低甲基化陽(yáng)性結(jié)果相符。

2.5 SALL4低甲基化改變與AML亞型的關(guān)系

AML患者WHO分型中，不同亞型的患者間SALL4低甲基化頻率不同，但7類(lèi)亞型間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，表1)。

2.6 SALL4低甲基化改變與染色體核型的關(guān)系

33例患者獲得染色體核型資料，其中，核型異常者占57.6%(19/33)。2例SALL4低甲基化陽(yáng)性患者染色體分析失敗，其余7例低甲基化陽(yáng)性患者均見(jiàn)于中危和高?；颊?，低?；颊呔匆?jiàn)SALL4低甲基化，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

表1 SALL4甲基化狀態(tài)與AML患者臨床特征的相關(guān)性

3 討論

DNA甲基化是細(xì)胞的一種表觀遺傳現(xiàn)象，在細(xì)胞分化、發(fā)育及增殖過(guò)程中起著十分重要的作用。DNA的異常甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，低甲基化改變是腫瘤形成過(guò)程中的一個(gè)特征性表觀遺傳學(xué)改變［11］。近年來(lái)，DNA甲基化已經(jīng)在腫瘤發(fā)生學(xué)領(lǐng)域得到廣泛研究，尤其是在腫瘤的早期診斷、分級(jí)分類(lèi)、疾病監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估中的潛在價(jià)值受到越來(lái)越多的關(guān)注。

本研究建立了SALL4基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的MSP技術(shù)，該方法經(jīng)證明具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，并且對(duì)1例隨機(jī)選取的陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)序證明其序列是正確的，保證了結(jié)果的可靠性，這些充分說(shuō)明我們建立的MSP技術(shù)可用于臨床標(biāo)本SALL4基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的檢測(cè)。本研究對(duì)45例AML患者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)初發(fā)AML患者中存在SALL4基因啟動(dòng)子低甲基化，其陽(yáng)性率為20.0%，與對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，揭示 SALL4啟動(dòng)子低甲基化改變可能與AML發(fā)病相關(guān)。

AML患者及白血病細(xì)胞株中SALL4基因啟動(dòng)子低甲基化和SALL4基因高表達(dá)相關(guān)，提示該基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)是調(diào)控該基因表達(dá)的一個(gè)機(jī)制。5-氮雜胞苷和5-氮雜-2'-脫氧胞苷是兩種強(qiáng)有力的DNA去甲基化藥物，現(xiàn)已用于治療骨髓增生異常綜合征和AML。但是，這類(lèi)藥物的弊端在于可以激活沉默的癌基因，使之表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)［11－12］。近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，SALL4基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)基因和維持側(cè)群細(xì)胞的數(shù)量而產(chǎn)生耐藥作用［13］，故AML患者中SALL4基因能否被激活還需要通過(guò)對(duì)DNA去甲基化藥物的臨床應(yīng)用加以確定。

AML患者中SALL4啟動(dòng)子低甲基化和患者的核型危險(xiǎn)分級(jí)相關(guān)。SALL4低甲基化只出現(xiàn)在中危和高?；颊咧?，未出現(xiàn)于t(8;21)或t(15;17)這類(lèi)預(yù)后良好的核型患者中，提示SALL4基因啟動(dòng)子低甲基化改變可能與AML患者預(yù)后相關(guān)。

我們的研究結(jié)果還表明，AML患者中SALL4低甲基化與高水平的白細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)，這點(diǎn)可能反映SALL4基因在控制白血病細(xì)胞的增殖中起作用。

綜上所述，SALL4低甲基化是AML患者中一個(gè)常見(jiàn)分子事件，可能與AML患者中高危核型相關(guān)。

［1］ Zhang J，Tam WL，Tong GQ，et a1.Sall4 modulates embryonic stem cell pluripotency and early embryonic development by the transcriptional regulation of Pou5f1［J］.Nat Cell Biol，2006，8(10):1114 －1123.

［2］ Yang J，Aguila JR，Alipio Z，et a1.Enhanced self-renewal of hematopoietic stem/progenitor cells mediated by the stem cell gene Sall4［J］.J Hematol Oncol，2011，4:38.

［3］ Ma Y，Cui W，Yang J，et al.SALL4，a novel oncogene，is constitutively expressed in human acute myeloid leukemia(AML)and induces AML intransgenic mice［J］.Blood，2006，108(8):2726 －2735.

［4］ Cui W，Kong NR，Ma Y，et a1.Differential expression of the novel oncogene，SALL4，in lymphoma，plasma cell myeloma，and acute lymphoblastic leukemia［J］.Mod Pathol，2006，19(20):1585 －1592.

［5］ 郭野，崔巍，崔京濤，等.急性髓細(xì)胞白血病中婆羅雙樹(shù)樣基因4的表達(dá)及其臨床意義［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32(1):25－29.

［6］ 陳芹，錢(qián)軍，林江，等.急性和慢性髓系白血病患者SALL4基因的表達(dá)［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013，21(2):315－319.

［7］ 林江，紀(jì)潤(rùn)璧，錢(qián)軍.轉(zhuǎn)錄因子婆羅雙樹(shù)樣基因4(SALL4)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2011，19(3):820－823.

［8］ Swerdlow SH，Campo E，Harris NL，et al.WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues in 2008［M］.Lyon，F(xiàn)rance:IARC Press，2008.

［9］ 李云，錢(qián)軍，陳芹，等.慢性髓系白血病PDLIM4基因表達(dá)與其啟動(dòng)子甲基化水平的關(guān)系［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，23(1):17－21，25.

［10］ Slovak ML，Kopecky KJ，Cassileth PA，et al.Karyotypic analysis predicts outcome of preremission and postremission therapy in adult acute myeloid leukemia:a SouthwestOncology Group/Eastern Cooperative Oncology Group Study［J］.Blood，2000，96(13):4075 －4083.

［11］ Esteller M.Epigenetics in cancer［J］.N Engl J Med，2008，358(11):1148 －1159.

［12］ Kelly TK，De Carvalho DD，Jones PA.Epigenetic modifications as therapeutic targets［J］.Nat Biotechnol，2010，28(10):1069 －1078.

［13］ Jeong HW，Cui W，Yang Y，et al.SALL4，a stem cell factor，affects the side population by regulation of the ATP-binding cassette drug transport genes［J］.PLoS One，2011，6(4):e18372.