黑色素瘤抗原-1誘導(dǎo)特異性抗肝癌免疫應(yīng)答

黃明宜，劉 賓，何 煒

1)河南中醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

腫瘤免疫治療是腫瘤生物治療的方法之一[1]。腫瘤的免疫治療是采用各種方法提高人體免疫系統(tǒng)的作用,從而達(dá)到遏制腫瘤生長(zhǎng)、破壞腫瘤細(xì)胞甚至消滅腫瘤細(xì)胞的目的。人體對(duì)抗腫瘤的免疫效應(yīng)機(jī)制包括兩個(gè)方面：非特異性免疫和特異性免疫；前者包括巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和多種細(xì)胞因子；后者包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面。臨床上已用IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并采用生物治療的方法來(lái)治療腫瘤，但其特異性不強(qiáng)，且毒副作用明顯。因此，需要發(fā)現(xiàn)特異性更高、更安全有效的方法來(lái)提高人體的免疫應(yīng)答能力。黑色素瘤抗原-1(melanoma antigen-1，MAGE-1)蛋白是用T細(xì)胞毒方法鑒定的第一個(gè)人類癌睪抗原。在許多體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)[2-6]，把MAGE-1蛋白作為靶位，通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)疫苗或基因疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，可以清除腫瘤或抑制腫瘤的生長(zhǎng)。但是，增加腫瘤細(xì)胞MAGE-1蛋白的表達(dá)能否增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，從而激活更多的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，引發(fā)更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，尚未見(jiàn)報(bào)道。作者將真核表達(dá)重組子pcDNA3.1-MAGE-1轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，觀察抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)；用真核表達(dá)重組子pcDNA3.1-MAGE-1注射免疫小鼠，觀察其誘發(fā)的抗腫瘤免疫效應(yīng)，探討其作為抗腫瘤DNA疫苗的可行性。

1 材料與方法

1.1主要試劑、細(xì)胞與動(dòng)物淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海奇康生物科技有限公司； RPMI 1640購(gòu)自Hycolone公司；胎牛血清購(gòu)自Corning公司；真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Roche公司；rhGM-CSF、rhIL-2、rhIL-4、rhTNF-α購(gòu)自R&D System公司；小鼠IFN-γ、小鼠IL-2定量ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海雄森科技實(shí)業(yè)有限公司；小鼠肝癌細(xì)胞株H22、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心；雄性C57BL小鼠，22～25 g，SPF級(jí)，購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；pcDNA3.1-MAGE-1由鄭州大學(xué)臨床腫瘤實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[7]；外周血取自25歲健康男性志愿者。

1.2引物及水解探針的設(shè)計(jì)目的基因MAGE-1、內(nèi)參基因GAPDH的Real-time PCR 引物及水解探針均由Roche公司設(shè)計(jì)；引物由上海生工生物公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞分組及處理 將SMMC-7721細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于6孔板上，當(dāng)細(xì)胞貼壁面積達(dá)60%～70%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MAGE-1重組子，按LipofectamineTM2000的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后換液，用G418(300 g/L)篩選，每2 d換液1次。設(shè)置pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組(空質(zhì)粒組)和未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染10 d后，空白對(duì)照組細(xì)胞全部被G418殺死，此時(shí)將G418改成維持濃度50 g/L，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達(dá)MAGE-1融合蛋白的細(xì)胞系SMMC-7721-MAGE-1和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系SMMC-7721-pcDNA3.1。

1.3.2 各組細(xì)胞MAGE-1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721-MAGE-1、SMMC-7721-pcDNA3.1以及SMMC-7721細(xì)胞，Real-time PCR法測(cè)MAGE-1 mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA。PCR反應(yīng)體系包括上下游引物各0.5 μmol/L、cDNA 2 μL、水解探針0.1 μmol/L、LightCycler Taq Man Master Mix 4 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 12 min, 95 ℃ 10 s，54 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共30個(gè)循環(huán)；40 ℃冷卻30 s 結(jié)束反應(yīng)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。以目的基因與內(nèi)參基因熒光灰度值的比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 細(xì)胞凍融抗原的制備 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌并懸浮細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107mL-1，移入EP管內(nèi)，置于液氮中10 min，再迅速放入37 ℃水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，如此反復(fù)凍融3次后，15 000 r/min離心30 min，收集上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后作為可溶性抗原，稀釋10倍，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 外周血DC的分離及致敏 外周血標(biāo)本中加入RPMI 1640稀釋2倍后沿管壁緩慢加入到含淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，2 000 r/min離心25 min，毛細(xì)吸管吸出白色單個(gè)核細(xì)胞層，加入適量RPMI 1640吹打混勻后1 500 r/min離心8 min，PBS洗滌3次。用含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的雙抗RP MI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于24孔板，每孔2×107個(gè)細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)2 h，使DC貼壁，2 h后吸出懸浮的淋巴細(xì)胞，每孔加入rhGM-CSF(100 mg/L)、rhTNF-α(20 mg/L)和rhIL-4(10 mg/L)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d半量換液1次。第3天換液時(shí)加入凍融抗原100 μL。再3 d 后，吸取疏松貼壁的增殖性細(xì)胞聚集體，置于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，過(guò)夜后收取懸浮細(xì)胞，即獲得成熟的DC。

1.3.5 T細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 待DC貼壁后，輕輕吸出上清置培養(yǎng)瓶中，用尼龍毛吸附法分離T淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入rhIL-2(5 mg/L)，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.6 CTL實(shí)驗(yàn) 將成熟的DC與T淋巴細(xì)胞混合共培養(yǎng)3 d，得CTL。以CTL為效應(yīng)細(xì)胞，SMMC-7721細(xì)胞為靶細(xì)胞，按效靶比401混合后接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后，各組細(xì)胞離心，取上清液50 μL至另一96孔板，以42.5 μL細(xì)胞培養(yǎng)液+7.5 μL Lysis Solution為體積校正對(duì)照，50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液為背景對(duì)照，每孔各加入50 μL Substrate Mix，室溫避光作用30 min，終止反應(yīng)。測(cè)量490 nm吸光度(A)值。計(jì)算CTL殺傷率[8]。

1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 動(dòng)物分組及免疫 將48只C57BL小鼠隨機(jī)分成重組子組、空質(zhì)粒組和PBS組，每組16只。免疫前3天每只小鼠在兩側(cè)股四頭肌各注射2.5 g/L鹽酸布比卡因50 μL。免疫方法：3組小鼠分別注射pcDNA3.1-MAGE-1、pcDNA3.1和PBS 100 μL，質(zhì)粒濃度 1 g/L，兩側(cè)股四頭肌每側(cè)各50 μL，共免疫3次，每次間隔10 d。

2011年6月中旬，按照發(fā)展家庭服務(wù)業(yè)促進(jìn)就業(yè)部際聯(lián)席會(huì)議的要求，四川省發(fā)展家庭服務(wù)業(yè)促進(jìn)就業(yè)聯(lián)席會(huì)議辦公室印發(fā)了《關(guān)于開(kāi)展家庭服務(wù)企業(yè)摸底調(diào)查的通知》（川家服辦發(fā)【2011】3號(hào)）。通過(guò)為期近兩個(gè)月的工作，共收到來(lái)自成都、內(nèi)江、資陽(yáng)、樂(lè)山、廣元、瀘州、德陽(yáng)、眉山、達(dá)州、綿陽(yáng)、攀枝花、阿壩、涼山、甘孜14個(gè)市（州）統(tǒng)計(jì)上報(bào)的家庭服務(wù)企業(yè)（單位）695個(gè)。綜合其他方面信息，現(xiàn)在全省擁有各類家庭服務(wù)機(jī)構(gòu)約5000個(gè)。其中，家政服務(wù)公司3000家，公益性家庭服務(wù)組織2000個(gè)。家政服務(wù)公司主要分布在成都、綿陽(yáng)、樂(lè)山等經(jīng)濟(jì)比較發(fā)達(dá)的城市，以中介式服務(wù)公司為主。成都已經(jīng)建立96118家政服務(wù)平臺(tái)。

1.4.2 小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子IL-2 和IFN-γ的測(cè)定及股四頭肌MAGE-1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 重組子組小鼠第3次免疫后的第3天，在無(wú)菌條件下每組各取8只小鼠脾臟。用針?biāo)▽⑵⑴K搗碎，PBS洗滌，制成單細(xì)胞懸液,用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的雙抗培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107mL-1，接種于24孔板中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)48 h后，取上清液，ELISA試劑盒檢測(cè)IFN-γ和IL-2的濃度。同時(shí)取小鼠股四頭肌，半定量RT-PCR法檢測(cè)MAGE-1 mRNA表達(dá)情況。

1.4.3 小鼠生存時(shí)間測(cè)定 每組剩下的8只小鼠在第3次免疫后的第6天腹腔注射接種鼠源肝癌細(xì)胞H22。接種方法：常規(guī)培養(yǎng)H22，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108mL-1，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。常規(guī)飼養(yǎng)，直至死亡。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0 處理數(shù)據(jù)。各組MAGE-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量、CTL殺傷率和各組小鼠生存時(shí)間的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 3組細(xì)胞MAGE-1 mRNA的表達(dá) 見(jiàn)表1。

見(jiàn)表1。

表1 3組細(xì)胞MAGE-1 mRNA表達(dá)和CTL殺傷率比較

與空白對(duì)照和空質(zhì)粒組比較，P<0.05。

2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-γ和IL-2的含量

PBS組和空質(zhì)粒組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-2的含量為0；而重組子組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量為(372.33±10.08) ng/L，IL-2 的含量為(108.67±12.81) ng/L。

2.2.2 MAGE-1 mRNA基因在小鼠股四頭肌組織中的表達(dá) 重組子組小鼠股四頭肌組織表達(dá)MAGE-1 mRNA，而空質(zhì)粒組和PBS組小鼠均不表達(dá)(圖1)。

圖1 3組小鼠股四頭肌組織中MAGE-1 mRNA的表達(dá)

2.2.3 小鼠荷瘤生存時(shí)間測(cè)定結(jié)果 PBS組小鼠接種腫瘤后第10天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，第13天全部死亡，生存時(shí)間為(12.0±1.1) d；空質(zhì)粒組小鼠接種腫瘤后第11天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，第16天全部死亡，生存時(shí)間為(13.1±1.7) d；重組子組小鼠接種腫瘤后第14天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，第20天全部死亡，生存時(shí)間為(17.4±1.6) d。3組生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.837，P<0.001)，重組子組小鼠生存時(shí)間比其他2組延長(zhǎng)。

3 討論

機(jī)體識(shí)別腫瘤進(jìn)而發(fā)動(dòng)免疫攻擊的物質(zhì)基礎(chǔ)是腫瘤抗原。CD8+CTL通過(guò)識(shí)別腫瘤抗原來(lái)特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。迄今已發(fā)現(xiàn)8個(gè)由MAGE-1基因編碼的HLA-I類分子限制的CTL表位[9]，提示可利用MAGE-1制備腫瘤疫苗，并用于腫瘤的特異性免疫治療。DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞, 在誘導(dǎo)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。其能在體內(nèi)、體外激活初始型T 細(xì)胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控、維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)[10]。腫瘤細(xì)胞抗原致敏的DC既具有腫瘤特異性，又能提供激活T細(xì)胞所必需的共刺激信號(hào)，具有很強(qiáng)的腫瘤免疫原性。

該研究采用反復(fù)凍融法制備肝癌細(xì)胞抗原。此種抗原具有多種抗原表位,更有利于DC遞呈腫瘤抗原。在DC前體期使其負(fù)載該細(xì)胞凍融抗原，腫瘤抗原被DC攝取，經(jīng)過(guò)抗原處理加工成為抗原肽，被運(yùn)送到DC表面，通過(guò)MHC限制性途徑激活T細(xì)胞，發(fā)揮特異性抗腫瘤效應(yīng)。

作者采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法將純化的質(zhì)粒pcDNA3.1-MAGE-1轉(zhuǎn)染入SMMC-7721細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞MAGE-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高。同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞負(fù)載的腫瘤抗原致敏的DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的體外殺傷性明顯增強(qiáng)。提示MAGE-1可增強(qiáng)SMMC-7721細(xì)胞的免疫原性，從而顯著增強(qiáng)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷活性。

MAGE-1基因的DNA疫苗通過(guò)注射導(dǎo)入C57BL小鼠后，可能通過(guò)不同的方式被攝取、加工、處理和遞呈給免疫效應(yīng)細(xì)胞[11]。被分泌到細(xì)胞外的抗原，可以被抗原遞呈細(xì)胞(包括B細(xì)胞)所攝取，加工處理后以抗原肽MHCⅡ類分子復(fù)合物的形式遞呈給CD4+T細(xì)胞，刺激CD4+T細(xì)胞活化增殖。在IL-4、IL-10的作用下，CD4+Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，一方面通過(guò)分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，參與B細(xì)胞增殖、成熟和促進(jìn)抗體生成，增強(qiáng)特異性抗體介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答；另一方面使部分B細(xì)胞增殖成為記憶B細(xì)胞，產(chǎn)生對(duì)特異抗原蛋白的免疫記憶。而在IFN-γ、IL-2的作用下，CD4+Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，通過(guò)分泌IL-2、IFN-γ，參與TDTH和Tc細(xì)胞的增殖、分化和成熟，同時(shí)活化巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬殺傷能力[12]。在APC內(nèi)表達(dá)的抗原蛋白被加工處理以后以抗原肽MHCⅠ類分子復(fù)合物的形式呈遞給CD8+T細(xì)胞，使之分化成為CTL和記憶細(xì)胞，發(fā)揮特異性細(xì)胞免疫功能和形成免疫記憶。

該研究通過(guò)對(duì)小鼠注射真核表達(dá)重組子pcDNA3.1-MAGE-1，使其在小鼠體內(nèi)表達(dá)。小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到INF-γ、IL-2 ，說(shuō)明T細(xì)胞在向Th1細(xì)胞分化，也就是引發(fā)了小鼠MAGE-1特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過(guò)生存時(shí)間的測(cè)定，作者發(fā)現(xiàn)重組子組荷瘤小鼠生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。該研究結(jié)果預(yù)示MAGE-1在腫瘤的免疫治療中具有極其光明的應(yīng)用前景。

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