p53抑制劑pifithrin-α對(duì)肝原代細(xì)胞增殖的影響

劉曙正,Henrik HS,段廣才

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤防治辦公室 鄭州 450008 3)挪威奧斯陸大學(xué)醫(yī)院病理研究所 奧斯陸 挪威 0027

p53基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變[1]。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道p53起到抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，但有研究表明肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)P53蛋白，提示P53蛋白可能也具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[2]。從肝組織中提取肝細(xì)胞(肝原代細(xì)胞)體外培養(yǎng)后，細(xì)胞具有與體內(nèi)相似的生理過(guò)程，因此常用來(lái)代替動(dòng)物模型研究體內(nèi)細(xì)胞的生理機(jī)制。肝細(xì)胞體外培養(yǎng)后即從靜止期進(jìn)入G1期，但只有在外源性的生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)刺激下,細(xì)胞才能通過(guò)G1/S期限制點(diǎn)，繼續(xù)增殖。EGF刺激細(xì)胞后可以激活MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終Erk磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核。而持續(xù)的Erk磷酸化可以促進(jìn)Cyclin D的表達(dá)[3-5]。細(xì)胞周期由不同種類(lèi)的周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)和Cyclin結(jié)合推進(jìn)，而CDK蛋白水平在各個(gè)細(xì)胞周期中保持恒定，因此細(xì)胞周期的推進(jìn)主要依賴(lài)Cyclin水平的變化。Cyclin E和Cyclin D是G1期的主要調(diào)控蛋白。P21是P53轉(zhuǎn)錄因子的直接下游產(chǎn)物之一[6]，因此可以間接反映P53蛋白的功能水平。該研究觀察了p53抑制劑pifithrin-α對(duì)肝原代細(xì)胞增殖及增殖相關(guān)蛋白P53、P21、Cyclin D、Cyclin E及磷酸化Erk(pErk)蛋白表達(dá)的影響，探討P53蛋白在肝細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器氚標(biāo)記的胸苷、 Kodak Image Station 4000R購(gòu)自英國(guó)GE Healthcare 公司，pifithrin-α購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司。Williams medium E培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。DC protein assay試劑購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。Cyclin E和P53抗體、Thr202/204位點(diǎn)磷酸化的Erk抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signalling Technology公司，Cyclin D和P21抗體購(gòu)自美國(guó)Upstate Biotechnology公司，β-tubulin抗體購(gòu)自Sigma Aldrich公司。二抗為HRP連接的山羊源性抗兔IgG、驢源性抗鼠IgG，均購(gòu)自Sigma Aldrich公司。

1.2肝原代細(xì)胞的提取和培養(yǎng)雄性成年Wistar大鼠, 體質(zhì)量200～220 g。使用改良的體外膠原酶灌注兩步分離術(shù)提取肝原代細(xì)胞[7-8]，按20 000 cm-2的密度于Williams medium E培養(yǎng)液、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞增殖檢測(cè)將肝原代細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板上，每3孔為一組，于培養(yǎng)23 h后分別加入pifithrin-α 0、10、20和30 μmol/L，1 h后添加10 nmol/L EGF誘導(dǎo)24 h, 然后添加氚標(biāo)記的胸苷(1 μCi/L)，EGF誘導(dǎo)30、36和48 h后收集細(xì)胞，用三氯乙酸沖洗2×10 min。未被沖洗掉的細(xì)胞由0.3 mL/孔的1 mol/L KOH溶解，用液體閃爍儀進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)，使用DC protein assay檢測(cè)。用放射性計(jì)數(shù)與細(xì)胞蛋白濃度的比值表示增殖水平。

1.4P53、P21、CyclinD、CyclinE、pErk蛋白的檢測(cè)將肝原代細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板上,每6孔為一組，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，EGF組用10 nmol/L的EGF誘導(dǎo)培養(yǎng)，EGF+pifithrin-α組用30 μmol/L的pifithrin-α和10 nmol/L的EGF誘導(dǎo)培養(yǎng)(方法同1.3)。EGF誘導(dǎo)24、30 h后收集細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)P53、P21、Cyclin D、Cyclin E、pErk蛋白(抗體均按1 000倍稀釋)，以β-tubulin為內(nèi)參。使用Kodak Image Station 4000R測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與β-tubulin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。 采用4×3析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖水平；因蛋白表達(dá)水平方差不齊，故使用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)比較各組蛋白的表達(dá)水平；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，pifithrin-α在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)EGF誘導(dǎo)的肝原代細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且抑制程度隨pifithrin-α濃度的增大而增加。

表1 細(xì)胞增殖測(cè)定結(jié)果(n=3) pCi·L/g

F劑量=54.690,F時(shí)間=214.370,F交互=50.450,P均<0.001。

2.2目標(biāo)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果各蛋白檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。可以看出，3組細(xì)胞P53、Cyclin E蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但EGF組P21、Cyclin D及 pErk蛋白表達(dá)水平升高，而EGF+pifithrin-α組P21、Cyclin D及pErk表達(dá)水平較EGF組降低。

圖1 EGF誘導(dǎo)后各組細(xì)胞P53、P21、Cyclin D、Cyclin E及pErk蛋白的表達(dá)

表2 各組細(xì)胞目標(biāo)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果(n=6)

3 討論

P53蛋白是人源性或鼠源性TGFα的轉(zhuǎn)錄起始因子[9]。EGF具有與TGFα相似的結(jié)構(gòu)，可與相同的受體EGFR結(jié)合，同樣可以激活MAPK通路，最終Erk磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核。而持續(xù)的Erk磷酸化可以促進(jìn)Cyclin D的表達(dá)[3-5]。Cyclin D和Cyclin E分別與CDK2和CDK4結(jié)合成復(fù)合物，磷酸化激活Rb蛋白家族，Rb蛋白依次磷酸化后釋放與之結(jié)合的E2F因子并促使細(xì)胞進(jìn)入S期[7，9]。

pifithrin-α是P53抑制劑，通過(guò)阻止P53蛋白進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其生理作用。該研究結(jié)果顯示，pifithrin-α可以抑制EGF誘導(dǎo)的肝原代細(xì)胞的增殖；實(shí)驗(yàn)中雖然未能檢測(cè)到P53蛋白表達(dá)有變化，但EGF誘導(dǎo)后，肝原代細(xì)胞P21表達(dá)增高，也間接說(shuō)明EGF激活了P53蛋白，提示P53蛋白在肝細(xì)胞增殖中具有一定作用。

EGF誘導(dǎo)后肝原代細(xì)胞Cyclin E的表達(dá)水平不變而Cyclin D的表達(dá)增高，說(shuō)明Cyclin D是肝細(xì)胞增殖的主要調(diào)控蛋白。而pifithrin-α抑制EGF誘導(dǎo)的肝原代細(xì)胞Cyclin D的表達(dá)，也證實(shí)了P53蛋白通過(guò)調(diào)控Cyclin D的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。作者還觀測(cè)到pifithrin-α可以抑制肝原代細(xì)胞Erk的磷酸化水平，這與文獻(xiàn)[8]報(bào)道結(jié)果一致。因?yàn)镃yclin D并不是P53蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控產(chǎn)物，所以P53蛋白可能是通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成的TGFα激活MAPK傳導(dǎo)通路，從而參與Cyclin D表達(dá)的調(diào)控。

綜上所述，P53蛋白具有促進(jìn)肝原代細(xì)胞增殖的作用，其作用機(jī)制可能與轉(zhuǎn)錄生成的TGFα激活MAPK信號(hào)通路后，上調(diào)Cyclin D的表達(dá)有關(guān)，但其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。肝癌細(xì)胞中p53基因突變并不少見(jiàn)，因此必然存在某種補(bǔ)償機(jī)制確保細(xì)胞在P53蛋白功能缺失的情況下繼續(xù)增殖，研究這種補(bǔ)償機(jī)制可為肝癌的分子靶向治療提供新的思路。

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