舒尼替尼聯(lián)合多西他賽對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及c-met、mek、erk mRNA表達(dá)的影響

蔡 晶，韓 娜，張 芳，方 黎，鄭鵬遠(yuǎn)，張中冕

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014

肺癌是目前全球最常見、對(duì)人類生命與健康危害最大的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位，且發(fā)病率仍呈逐年上升的趨勢(shì)。其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%；70%～80%的非小細(xì)胞肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)是肺癌晚期，早期患者術(shù)后仍有30%～70%會(huì)發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-2]。藥物治療目前仍是晚期肺癌治療的重要手段之一，但是治療結(jié)果仍不令人滿意。因此，探索新的治療方案是必要的。有臨床研究[3-4]顯示分子靶向藥物聯(lián)合化療可進(jìn)一步提高療效。舒尼替尼是一種口服的小分子酪氨酸激酶抑制劑，具有強(qiáng)力的抗血管生成作用和抗腫瘤作用[3]。多西他賽是一種半合成的紫杉烷類抗癌藥物，與β微管蛋白結(jié)合，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。在美國(guó)，多西他賽既可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以與其他藥物聯(lián)合治療實(shí)體瘤如肺癌、乳癌等[5]。該研究旨在探討多西他賽和舒尼替尼單用或聯(lián)用對(duì)人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549的影響。

1 材料與方法

1.1材料A549細(xì)胞株由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。舒尼替尼購(gòu)自Pfizer公司，多西他賽購(gòu)自英國(guó)Aventis Pharma Dagenham公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、2.5 g/L胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、Annexin V-FITC和PI凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，EPICS-ALTRA 型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(內(nèi)含青霉素100 kU/L、鏈霉素100 mg/L)于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代 1 次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以5×107L-1接種于 96 孔板，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)Ⅰ：兩藥同時(shí)給藥對(duì)A549細(xì)胞的影響。待細(xì)胞貼壁后分4組處理。對(duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基；多西他賽單藥組給予含多西他賽(終質(zhì)量濃度16 mg/L，下同)的培養(yǎng)液；舒尼替尼單藥組給予含舒尼替尼(終濃度7.5 μmol/L，下同)的培養(yǎng)液；舒尼替尼+多西他賽組給予含舒尼替尼和多西他賽的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)Ⅱ：兩藥不同順序給藥對(duì)A549細(xì)胞的影響。多西他賽→舒尼替尼組(D→S組)，先加入100 μL含多西他賽的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液后，再加入100 μL含舒尼替尼的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。舒尼替尼→多西他賽組(S→D組)，先加入100 μL含舒尼替尼的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液后，再加入100 μL含多西他賽的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3A549細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)Ⅰ分組細(xì)胞按以上分組處理后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加入5 g/L MTT 20 μL，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)，取均值。增殖抑制率=(空白對(duì)照孔A-實(shí)驗(yàn)孔A)/空白對(duì)照孔A×100%。實(shí)驗(yàn)Ⅱ分組細(xì)胞參照以上步驟處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4A549細(xì)胞凋亡率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)Ⅰ分組細(xì)胞按以上分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸除培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化，懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管離心后，去上清，經(jīng)吹打、收集、離心，冷PBS洗2次后，用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞(細(xì)胞密度1×109L-1)。取100 μL重懸液，加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,輕輕混勻,室溫暗室孵育15 min。每管加400 μL 1×結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀,檢測(cè)細(xì)胞凋亡 (包括早期、晚期和總凋亡率)。同時(shí)記錄細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)Ⅱ分組細(xì)胞參照以上步驟處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5A549細(xì)胞中c-met、mek、erkmRNA的表達(dá)水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)Ⅰ分組細(xì)胞按以上分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，按Trizol 試劑盒說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)驗(yàn)所用引物如下。c-met：上游引物為5’-GGTTTTTCCTGTGGCTGAAA-3’，下游引物為5’-CACAACCAAAATGCCCTCTT-3’，目的基因426 bp； mek：上游引物為5’-CCTTGAGGC CTTTCTTACCC-3’，下游引物為5’-ATGTTG GAGGGCTTGACATC-3’，目的基因441 bp；erk：上游引物為5’-CCAGACCATGATCACACAGG-3’，下游引物為5’-CTCGTCACTCGGGTCGTAAT-3’，目的基因441 bp；β-actin：上游引物為5’-TGACGTGGACATC CGCAAAG-3’, 下游引物為5’-CTGGAAGGTGGA CAGCGAGG-3’，目的基因205 bp。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95、57和72 ℃各30 s，35個(gè)循環(huán)(β-actin為30個(gè)循環(huán))；72 ℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外線投射儀觀察電泳條帶，并用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以目的條帶和β-actin條帶灰度的比值作為該基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)Ⅱ分組細(xì)胞參考以上步驟處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0處理數(shù)據(jù)。采用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較舒尼替尼和多西他賽單藥給藥及二者聯(lián)合給藥時(shí)細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、細(xì)胞周期及3個(gè)基因mRNA表達(dá)水平的差異，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對(duì)以上指標(biāo)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響見表1。結(jié)果顯示，相對(duì)于單獨(dú)用藥，多西他賽、舒尼替尼聯(lián)合用藥抑制了細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間依賴性。

表1 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥不同時(shí)間A549細(xì)胞的增殖抑制率(n=3) %

F多西他賽=17 228.952，F(xiàn)舒尼替尼=17 171.938，F(xiàn)時(shí)間=5 048.055，F(xiàn)交互=352.276，F(xiàn)多西他賽×舒尼替尼=6 019.386，P均<0.001。

2.2舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥對(duì)A549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響見表2、3。結(jié)果顯示，多西他賽、舒尼替尼聯(lián)合用藥較單獨(dú)用藥A549細(xì)胞晚期凋亡率及總凋亡率均增加，S期細(xì)胞減少。

表2 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥48 h對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(n=3) %

表3 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥48 h對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞周期的影響(n=3) %

2.3舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥對(duì)A549細(xì)胞3個(gè)基因mRNA表達(dá)水平的影響見表4。結(jié)果顯示用藥后c-met、mek mRNA表達(dá)下調(diào)，erk mRNA表達(dá)上調(diào)；聯(lián)合用藥時(shí)erk mRNA表達(dá)上調(diào)，優(yōu)于單獨(dú)用藥。

表4 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥48 h后3個(gè)基因mRNA表達(dá)水平(n=3)

2.4舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響D→S組細(xì)胞增殖抑制率為(81.563±0.628)%，高于S→D組的(64.126±1.600)%(t=13.554,P=0.005)。

2.5舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對(duì)A549細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響見表5、6。結(jié)果顯示D→S組與S→D組早期、晚期及總凋亡率均有差異；D→S組較S→D組G2/M期、S期細(xì)胞增多，G0/G1期細(xì)胞減少。

2.6舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對(duì)A549

細(xì)胞c-met、mek、erkmRNA表達(dá)水平的影響見表7。結(jié)果顯示D→S組較S→D組c-met、mek mRNA表達(dá)水平下調(diào)，erk mRNA表達(dá)水平上調(diào)。

表5 舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(n=3) %

表6 舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞周期的影響(n=3) %

表7 舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對(duì)3個(gè)基因mRNA表達(dá)水平的影響(n=3)

3 討論

舒尼替尼是一種多靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑,能同時(shí)抑制多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，具有抗腫瘤生長(zhǎng)和抗血管生成作用，最終影響惡性腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。多西他賽是一種紫杉烷類化合物。多西紫杉醇已被證明能夠在體外抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和毛細(xì)血管的形成，且呈劑量依賴性[6]。

該研究結(jié)果顯示舒尼替尼與多西他賽均能誘導(dǎo)A549的凋亡。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同的給藥組合和次序?qū)549細(xì)胞增殖的影響不同，其中聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用大于單獨(dú)用藥，不同順序給藥中D→S方式優(yōu)于S→D方式。

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示：舒尼替尼和多西他賽對(duì)于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響不同，聯(lián)合用藥誘導(dǎo)的晚期及總凋亡率均高于單藥，且S期細(xì)胞減少；D→S方式誘導(dǎo)的早期凋亡率高于S→D方式，晚期和總凋亡率也有所差異。細(xì)胞周期分析則顯示與S→D方式比較，D→S方式作用后，細(xì)胞多阻滯于G2/M期、S期，G0/G1期細(xì)胞減少。

c-met為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，具有酪氨酸激酶活性，與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重排的調(diào)控，是細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)的重要因素。c-met/ras/raf/mek/erk信號(hào)通路是一個(gè)小GTP結(jié)合蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞質(zhì)蛋白激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是眾多MAPK通路中的一個(gè)。MAPK通路的核心包括3種蛋白激酶：①M(fèi)AP-KKK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，raf為重要的一員。②MAPKK具有磷酸化蘇/酪氨酸殘基的雙特異功能，mek為重要的一員。③MAPK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，erk為重要的一員。受體酪氨酸激酶發(fā)生羧基端過度磷酸化，刺激ras-GDP轉(zhuǎn)換為ras-GTP，從而導(dǎo)致ras激酶過度活化[7-8]，活化的raf 進(jìn)一步磷酸化激活mek，活化的mek激活erk，最后活化的erk激活或失活多種靶蛋白。c-met/ras/raf/mek/erk持續(xù)激活，最終導(dǎo)致異常細(xì)胞增殖及腫瘤形成。

RT-PCR結(jié)果顯示，與S→D方式比較，D→S方式作用后，細(xì)胞c-met、mek mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，erk表達(dá)水平明顯上調(diào)。推測(cè)多西他賽先激活下游信號(hào)erk，使之磷酸化[9-10]，隨之舒尼替尼抑制這些信號(hào)，從而增加了細(xì)胞對(duì)舒尼替尼的敏感性。

總之，舒尼替尼和多西他賽能夠抑制A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，二藥聯(lián)用有交互作用；二藥不同順序給藥時(shí)，D→S優(yōu)于S→D的給藥方式。以上結(jié)果顯示，靶向藥物與化療存在最佳的給藥順序，先化療后給予靶向藥物可能會(huì)獲得更好的臨床效果。然而，舒尼替尼作為一種多靶點(diǎn)的藥物，抗腫瘤機(jī)制復(fù)雜。該研究尚未探索舒尼替尼與多西他賽不同順序給藥對(duì)實(shí)體瘤的影響，今后仍需開展更加深入的研究。

[1] Greenlee RT, Hill-Harmon MB，Murray T, et al. Cancer statistics, 2001[J]. CA Cancer J Clin, 2001, 51(1):15

[2] DeSantis C, Siegel R, Bandi P, et al. Breast cancer statistics, 2011[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(6):409

[3] Christensen JG. A preclinical review of sunitinib, a multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor with anti-angiogenic and antitumour activities[J]. Ann Oncol, 2007, 18(Suppl 10):x3

[4] Montero A, Fossella F, Hortobagyi G, et al. Docetaxel for treatment of solid tumours: a systematic review of clinical data [J]. Lancet Oncol, 2005, 6(4):229

[5] Fossella FV, DeVore R, Kerr RN, et al. Randomized phase Ⅲ trial of docetaxel versus vinorelbine or ifosfamide in patients with advanced non-small-cell lung cancer previously treated with platinum-containing chemotherapy regimens. The TAX 320 Non-Small Cell Lung Cancer Study Group[J]. J Clin Oncol, 2000，18(12): 2354

[6] Wasylyk C, Zheng H, Castell C, et al. Inhibition of the Ras-Net (Elk-3) pathway by a novel pyrazole that affects microtubules [J]. Cancer Res, 2008，68(5):1275

[7] Rajalingam K，Rudel T. Ras-Raf signaling needs prohibitin[J]. Cell Cycle, 2005, 4(11):1503

[8] Rajalingam K, Wunder C, Brinkmann V, et al. Prohibitin is required for Ras-induced Raf-MEK-ERK activation and epithelial cell migration [J]. Nat Cell Biol, 2005, 7(8):837

[9] Liebmann C. Regulation of MAP kinase activity by peptide receptor signalling pathway: paradigms of multiplicity [J]. Cell Signal, 2001，13(11):777

[10]Zhu XF, Liu ZC, Zeng YX. Tyrosine kinase receptor-mediated signal transduction and cancer treatment[J]. Yao Xue Xue Bao, 2002, 37(3):229