重組人粒細胞集落刺激因子對急性缺血再灌注腦損傷大鼠腦組織Egr-1、Survivin蛋白表達及血管再生的影響

程鶴云，滕軍放，郭利利

鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450001

缺血性腦血管病發(fā)生后，盡快恢復缺血半暗帶血供對于減少神經(jīng)元凋亡，促進神經(jīng)功能修復有著重要意義。缺血后血管再生的情況與腦血管病的進展、轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。早期生長因子1(early growth response-1，Egr-1)可以調(diào)控VEGF的轉(zhuǎn)錄，從而促進血管重建。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)抗凋亡因子Survivin強烈表達于血管平滑肌細胞、體外立體管腔內(nèi)皮細胞和體內(nèi)新生毛細血管內(nèi)皮細胞，提示其在新生血管形成的過程中發(fā)揮著重要的作用。重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony simulating factor,rhG-CSF)是一類骨髓干細胞動員劑，可上調(diào)細胞因子的表達，特別是膠質(zhì)細胞有大量G-CSF受體存在。該實驗應用rhG-CSF干預大腦中動脈閉塞(MCAO)模型大鼠，觀察其對大鼠腦組織Egr-1、Survivin蛋白表達及血管再生的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑rhG-CSF(山東齊魯制藥有限公司)，MCAO模型專用尼龍線栓購于北京沙東生物制品公司，Egr-1、Survivin兔抗鼠多克隆抗體均購于北京博奧森生物有限公司，CD31鼠單克隆抗體購自美國 Santa Cruz公司，SP9000與DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2實驗動物及分組健康清潔級雄性SD大鼠72只(河南省實驗動物中心提供)，體質(zhì)量280～320 g。隨機分為假手術(shù)組，模型組和治療組，每組24只。模型組和治療組制作大鼠MCAO模型。治療組大鼠手術(shù)2 h后腹部皮下注射rhG-CSF 50 μg/(kg·d)，單次注射7.5 mL，連續(xù)用藥5 d；模型組和假手術(shù)組給予等體積生理鹽水，連續(xù)用藥5 d。各組分別于術(shù)后7、14和21 d處死 8只大鼠。

1.3MCAO模型制備麻醉大鼠，仰臥固定，頸部剪毛備皮，暴露、分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，模型組和治療組結(jié)扎頸外動脈及頸總動脈近心端，于頸總動脈入路插入線栓18～20 mm，有阻力感時(約至大腦中動脈起始部分叉處)，栓塞一側(cè)大腦中動脈供血區(qū)。假手術(shù)組不插線直接縫合。90 min后緩慢將線栓拔出，退至頸外動脈殘端，造模完成。大鼠清醒后以神經(jīng)行為學改變?yōu)橐罁?jù)，參考Zea Longa 評分法行單盲評分，篩選出神經(jīng)功能評分為1、2、3 分的大鼠。

1.4Egr-1、Survivin和CD31蛋白表達的檢測備用各組大鼠以300 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥固定，開胸，經(jīng)心尖至升主動脈入路，依次用生理鹽水、40 g/L甲醛溶液各200 mL灌注，然后斷頭完整取腦，置于甲醛溶液后固定2 h，蒸餾水浸泡4 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。于缺血半暗帶部位開始連續(xù)冠狀位切片，厚度7 μm，貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上，4 ℃保存。取切片常規(guī)脫蠟水化，經(jīng)蒸餾水沖洗后，按SP9000免疫組化試劑盒提供的實驗步驟操作，DAB 顯色，光鏡下觀察，胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性著色細胞。高倍鏡(×400)下在缺血半暗帶區(qū)隨機取5個視野，采用德國Lecia顯微照像系統(tǒng)行圖像采集，并應用生物數(shù)字圖像采集系統(tǒng)進行圖像分析(上海山富科學儀器有限公司，Biosens Digital Imaging System v1.6)，檢測各個視野平均灰度值，然后減去此片背景平均灰度值，取其相反數(shù)作為最終光密度(D)值。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0分析，各組大鼠腦組織Egr-1、Survivin和毛細血管密度的比較用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織缺血半暗帶Egr-1和Survivin蛋白的表達見表1和圖1、2。

表1 各組大鼠腦組織缺血半暗帶Egr-1和Survivin蛋白的表達

*與假手術(shù)組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠腦組織毛細血管假手術(shù)組可見稀疏毛細血管(圖3A)，模型組可見星形膠質(zhì)細胞浸潤及較多新生毛細血管(圖3B)，治療組視野下新生毛細血管最多(圖3C)。實驗14 d，假手術(shù)組、模型組和治療組大鼠腦組織毛細血管密度分別為每個高倍鏡視野(1.5±1.7)、(9.1±3.0)和(14.2±2.9)個(F=139.712，P<0.001)。模型組和治療組高于假手術(shù)組，治療組高于模型組。

圖2 各組大鼠腦組織Survivin蛋白的表達(SP，×400)

圖3 14 d各組大鼠毛細血管密度(SP，×400)

3 討論

MCAO模型大鼠的腦組織中存在模擬動脈粥樣硬化型腦梗死相似的缺血壞死區(qū)及缺血邊緣區(qū)，即缺血半暗帶。以rhG-CSF誘導血管再生的可能機制包括直接活化腦血管內(nèi)皮細胞、動員骨髓內(nèi)皮祖細胞進入腦缺血區(qū)以及誘導其他促血管再生因子，已知的作用機制還包括eNOS等表達上調(diào)，調(diào)控 VEGF通路，促進循環(huán)中的干細胞在缺血刺激的情況下遷移，尤其是造血干細胞遷移至受損部位。Zhao等[2]發(fā)現(xiàn)rhG-CSF對促進心肌梗死兔的受損部位微血管再生，促進受損組織的重塑和功能重建有重要作用。

Egr-1是由定位于人染色體5q23-31的Egr-1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的由533個氨基酸構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子。在神經(jīng)元損傷的修復、血管因子的表達、生長因子基因表達的調(diào)控及癌基因表達的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Egr-1的轉(zhuǎn)錄依賴Ras-Raf-MEK-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路。Egr-1可以通過與VEGF啟動子區(qū)富含鳥嘌呤序列[3]結(jié)合，調(diào)控VEGF的轉(zhuǎn)錄。王鵬等[4]通過腦膠質(zhì)瘤SHG44細胞的研究初步證明了Egr-1可介導Survivin促進血管形成。

Survivin蛋白是一類存在于哺乳動物細胞中的一類凋亡抑制蛋白家族中最晚發(fā)現(xiàn)的成員。由位于人17號染色體頂端Survivin基因轉(zhuǎn)錄而成的142個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量約為16 200的蛋白質(zhì)。有研究表明缺血再灌注損傷的腦組織中各種血管發(fā)生細胞因子都可通過調(diào)節(jié)Survivin的表達來調(diào)節(jié)正常血管內(nèi)皮細胞的凋亡或存活。破壞Survivin的表達能夠取消上述細胞因子的促血管發(fā)生作用[5-6]。

作者的研究發(fā)現(xiàn)，模型組Survivin及Egr-1蛋白的表達均較假手術(shù)組升高，可能與重建缺血半暗帶毛細血管，促進組織功能恢復有關(guān)，而rhG-CSF治療7和14 dSurvivin和Egr-1蛋白的表達均較模型組及假手術(shù)組上升更為明顯。實驗14 d后，治療組大鼠腦組織毛細血管密度高于其他2組。通過以上分析不難看出，rhG-CSF可提高Egr-1及Survivin蛋白的表達，并刺激毛細血管再生。

綜上所述，rhG-CSF可明顯增加MCAO大鼠腦組織Egr-1及Survivin蛋白的表達，并可促進缺血半暗帶微血管的再生，但其具體分子作用機制及遠期存活率及神經(jīng)功能改善情況仍需進一步研究探討。

[1] Simosa HF，Wang G，Sui X，et al.Survivin expression is up-regulated in vascular injury and identifies a distinct cellular phenotype[J].J Vasc Surg，2005，41(4)：682

[2] Zhao Q，Sun C，Xu X，et al.Early use of granulocyte colony stimulating factor improves survival in a rabbit model of chronic myocardial ischemia[J].J Cardiol，2013，61(1)：87

[3] O’ Connor DS,Schechner JS,Adida C,et al.Control of apoptosis during angiogenesis by survivin expression in endothelial Cells[J].Am J Pathol， 2000,156(2):393

[4] 王鵬.Egr-1介導膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)Survivin促進血管形成實驗研究[D].第四軍醫(yī)大學，2010.

[5] AbouAlaiwi WA, Ratnam S,Booth RL， et al. Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation[J]. Hum Mol Genet，2011，20(2): 354

[6] Zhu L，F(xiàn)ukuda S，Cordis G,et al.Anti-apoptotic protein surviving plays a significant role in tubular morphogenesis of human coronary arteriolar endothelial cells by hypoxic preconditioning[J].FEBS Lett,2001，508(3)：369