褪黑素對睡眠剝奪大鼠胃黏膜損傷的保護作用*

韓 俊，王 彬，馬 珂，閆昱博，董開源，劉芳娥

1)第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系 西安710032 2)第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系 西安710032 3)第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部教學(xué)實驗中心 西安 710032

睡眠不足在當(dāng)今處于重大工作壓力下的人群中很常見。睡眠不足可引起機體代謝紊亂，由此出現(xiàn)一系列健康問題。因此，研究睡眠剝奪對機體的不良影響及其防治措施很有意義。實驗[1-2]表明，睡眠剝奪作為一種強烈應(yīng)激源，對機體造成多方面負(fù)面影響，令動物或人產(chǎn)生疲勞、學(xué)習(xí)記憶受損和行為改變，還可以對機體的血液循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)臟器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生很大危害。還有研究[3]表明，應(yīng)激可引起胃黏膜損傷從而引起消化系統(tǒng)的功能障礙。具有抗氧化特性的褪黑素可以在應(yīng)激導(dǎo)致的機體損傷中起保護作用[4]。但是，褪黑素對應(yīng)激引起的胃黏膜損傷的保護作用機制尚不清楚，其相關(guān)報道較少。作者研究了褪黑素對睡眠剝奪大鼠胃黏膜損傷的影響及可能的作用機制，為睡眠剝奪引起的胃黏膜損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物、試劑及儀器成年、雄性、健康SD大鼠24只，體質(zhì)量(180±15) g(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)。褪黑素(Sigma公司，使用前需少量乙醇助溶，以生理鹽水配制成所需濃度，終溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)<5%)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。睡眠剝奪裝置、離心機、721分光光度計、恒溫水浴箱等。

1.2實驗分組將24只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組，每組8只。分別為在大平臺上不剝奪睡眠并注射生理鹽水的對照組，睡眠剝奪并注射生理鹽水的模型組，睡眠剝奪并注射褪黑素的實驗組。對照組和模型組于每日19: 00腹腔注射2 mL生理鹽水，實驗組腹腔注射15 mg/kg褪黑素2 mL，連續(xù)7 d。然后進(jìn)行睡眠剝奪3 d，期間依然按分組每日給藥。

1.3睡眠剝奪模型的建立采用小平臺水環(huán)境法[5]建立大鼠睡眠剝奪模型。制作30 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，其中有4個高8.0 cm、直徑6.3 cm的圓形平臺，在平臺周邊注滿水，水面低于平臺面約1.0 cm。水溫保持在20 ℃左右。大鼠在平臺上可自行進(jìn)食、飲水但不可睡眠。若其睡眠，則肌肉

張力松弛而落入水中，只能恢復(fù)清醒再爬上平臺，如此反復(fù)則為睡眠剝奪。睡眠剝奪前，在給予大鼠褪黑素或生理鹽水腹腔注射時，將各組大鼠放在沒有注水的睡眠剝奪箱內(nèi)，讓其熟悉睡眠剝奪環(huán)境7 d。然后對模型組和實驗組大鼠進(jìn)行睡眠剝奪72 h，對照組大鼠也置于相同的睡眠剝奪箱中，但是大鼠站立的平臺直徑為16 cm，大鼠在平臺上可以自由睡眠。大鼠活動空間內(nèi)持續(xù)40 W日光燈照射，室內(nèi)溫度控制在18～22 ℃。

1.4標(biāo)本采集取上述各組睡眠剝奪結(jié)束后的大鼠立即進(jìn)行眼球后靜脈叢取血并分離血清，然后沿劍突下正中剪開腹壁，暴露鼠胃，切下全胃，沿大彎側(cè)剪開胃壁，用生理鹽水沖洗干凈待檢。

1.5血清GSH、PGE2、MDA含量及胃黏膜損傷指數(shù)的測定取血清后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測量血清中GSH、PGE2及MDA含量。胃黏膜損傷指數(shù)的評定：胃黏膜損傷長度<1 mm為1分，1～ mm為2分，2～ mm為3分， 3～ mm為4分，4～ mm則分段測量并評分；病灶寬度>2 mm評分乘以2；最終計算全胃病灶總的評分即為胃黏膜損傷指數(shù)。

1.6胃黏膜組織病理觀察胃黏膜損傷指數(shù)測定完畢后，在損傷明顯處取組織，石蠟包埋，切片，HE染色，并在光鏡下觀察。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組間血清MDA、GSH、PGE2含量及胃黏膜損傷指數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠血清GSH、MDA及PGE2的含量模型組相對于對照組來說，MDA含量升高，GSH含量降低，PGE2含量升高。實驗組相對于模型組來說，MDA含量降低，GSH含量升高，PGE2含量降低。見表1。

2.2各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)結(jié)果顯示模型組胃黏膜損傷指數(shù)高于對照組，實驗組低于模型組。見表1。

2.3各組大鼠胃黏膜組織病理觀察對照組大鼠胃黏膜光整完好，淡紅色，質(zhì)地柔軟，肉眼少見糜爛及潰瘍；模型組大鼠胃黏膜均有不同程度的充血、水腫，可見散在點狀出血、糜爛；實驗組大鼠胃黏膜有輕度的糜爛和水腫。對照組大鼠鏡下黏膜層結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮層細(xì)胞完整，固有層腺體結(jié)構(gòu)完整，主細(xì)胞、壁細(xì)胞清晰可見，未見炎癥細(xì)胞；模型組大鼠鏡下黏膜層破壞，可見黏膜中斷現(xiàn)象，有局灶性壞死；實驗組鏡下黏膜層細(xì)胞脫落，有少量黏膜糜爛和壞死現(xiàn)象。見圖1。

表1 3組大鼠血清MDA、GSH、PGE2含量及胃黏膜損傷指數(shù)比較

*:與對照組相比,P<0.05；#:與模型組相比,P<0.05。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理觀察結(jié)果(HE，×400)

3 討論

睡眠是人和哺乳動物的基本生理需要，因此睡眠剝奪可引起機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。睡眠剝奪大鼠的病理變化以營養(yǎng)不良較為突出，主要繼發(fā)于能量消耗增多，體內(nèi)的氧自由基含量明顯增高，當(dāng)機體的抗氧化能力不足以清除增多的活性氧就會發(fā)生氧化應(yīng)激[6]。胃黏膜損傷指數(shù)是衡量睡眠剝奪對大鼠胃黏膜損傷的重要指標(biāo)。損傷程度同時也可通過潰瘍個數(shù)及潰瘍大小來表示。該研究結(jié)果顯示，實驗組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯低于模型組；模型組鏡下黏膜層多見病灶壞死區(qū)域，且出現(xiàn)黏膜層斷裂現(xiàn)象,而實驗組鏡下黏膜層少見潰瘍及病灶壞死區(qū)域,說明褪黑素對睡眠剝奪產(chǎn)生的應(yīng)激作用有明顯效果。對照組也出現(xiàn)潰瘍，可能由于每天腹腔注射對其造成了刺激從而導(dǎo)致大鼠應(yīng)激產(chǎn)生潰瘍。

褪黑素是由松果體、胃腸道、視網(wǎng)膜等多器官分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，是體內(nèi)抗自由基、抗氧化作用很強的活性物質(zhì)[7]；具有廣泛的生物學(xué)作用，除能直接清除和抑制氧自由基產(chǎn)生外，還能增強內(nèi)源性抗氧化酶的作用[8]。近年來其在消化系統(tǒng)疾病中的作用得到重視。

有研究[9]表明，氧自由基的大量產(chǎn)生在多種原因引起的胃黏膜損傷的病理過程中均起重要作用。而MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生的量與氧自由基的量及脂質(zhì)過氧化的程度呈正相關(guān)[10]，與自由基的清除能力呈負(fù)相關(guān)，是反映自由基對生物大分子的損傷程度及生物體抗氧化能力的最好指標(biāo)之一[11-12]，MDA增多與應(yīng)激作用有關(guān)。該研究結(jié)果表明，實驗組大鼠血清MDA含量明顯低于模型組,提示褪黑素對睡眠剝奪大鼠血清中MDA含量的升高有顯著的抑制作用，對胃黏膜的保護作用可能與抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)，在睡眠剝奪對機體造成氧化損傷時起保護作用。

機體可通過酶類和非酶類2種分子來保護氧化應(yīng)激的細(xì)胞，后者的代表為GSH。GSH是在肝內(nèi)由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽物質(zhì)，廣泛分布于機體各器官內(nèi)，是細(xì)胞內(nèi)重要的水溶性抗氧化劑，它含有巰基，通過巰基與體內(nèi)的自由基結(jié)合，對過氧化物、自由基和親電子基起拮抗作用，能清除過氧化代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞生物功能[13]。GSH清除過氧化物時需在谷胱甘肽過氧化物酶作用下轉(zhuǎn)化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSSG經(jīng)谷胱甘肽還原酶催化還原為GSH繼續(xù)發(fā)揮抗氧化功能。實驗組大鼠血清中GSH的含量明顯低于對照組但高于模型組，提示褪黑素可促進(jìn)血清中GSH含量的增高，對睡眠剝奪造成機體氧化損傷起到防護作用。

PGE2由胃黏膜產(chǎn)生并釋放入血，被認(rèn)為是胃黏膜的保護因子，可增加黏膜血流，為黏膜細(xì)胞供應(yīng)充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，還可抑制胃酸、胃蛋白酶原分泌，刺激黏液和碳酸氫鹽分泌來調(diào)節(jié)體內(nèi)酸堿度并維護胃黏膜的完整性，增強胃黏膜的防御功能[8]。在胃黏膜遭受應(yīng)激損害時，機體可以通過產(chǎn)生PGE2而起到對胃黏膜的保護作用。該研究結(jié)果中模型組大鼠血清PGE2含量明顯高于對照組，說明睡眠剝奪引起的胃潰瘍促使機體產(chǎn)生PGE2來應(yīng)對氧化應(yīng)激，以減少應(yīng)激帶來的不良影響。而實驗組PGE2含量明顯低于模型組，推測可能的原因是作者在對實驗組大鼠進(jìn)行睡眠剝奪之前就已經(jīng)用褪黑素進(jìn)行預(yù)處理，在睡眠剝奪期間，褪黑素對睡眠剝奪大鼠的胃黏膜損傷即起到了緩解或保護作用，從而使機體本身應(yīng)對應(yīng)激時的反應(yīng)沒有那么激烈，因此產(chǎn)生的PGE2也沒有模型組多，并猜測PGE2和褪黑素可能分別通過各自的途徑對氧化應(yīng)激引起的胃黏膜損傷起保護作用。該結(jié)果與Nassar等[14]的研究結(jié)果一致，而與王鑫國等[15]的研究結(jié)果并不完全一致，其具體機制尚有待進(jìn)一步研究。

睡眠障礙因素的不斷作用會導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生，將對機體產(chǎn)生巨大危害?，F(xiàn)在相當(dāng)多的人在研究如何減少睡眠剝奪所帶來的影響，從大腦、肝臟、免疫系統(tǒng)等方面分別闡述了睡眠剝奪的影響及可能的機制。作者著重強調(diào)對胃的研究，探討睡眠剝奪對消化系統(tǒng)的作用，為因睡眠剝奪產(chǎn)生的消化系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。褪黑素作為一種內(nèi)源性多效應(yīng)的生理活性物質(zhì)，具有低毒安全的特點[16]。迄今為止，其不良反應(yīng)僅為嗜睡，未見其他有關(guān)的毒理報道，在多種動物體內(nèi)也未建立其半數(shù)致死劑量， 故其臨床應(yīng)用具有較高的安全性和前景。

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