氟喹諾酮類藥物對動物源MRSA和MSSA的防耐藥變異濃度比較

楊 帆，李淑梅，王沛珍，趙林靜，何群力

2.河南科技學院，新鄉(xiāng) 453003；Email：yangf77＠163.com

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin－resistantS.aureus，MRSA）和甲氧西林敏感的金黃色 葡 萄 球 菌 （Methicillin－susceptibleS.aureus，MSSA）是引起醫(yī)院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌；同時也可引起動物的各種化膿性疾病。而且該病原菌可通過各種途徑在人和動物之間傳播，近年來研究報道耐藥性的金黃色葡萄球菌（尤其是 MRSA）在動物和人之間傳播呈現(xiàn)上升趨勢[1－2]，所以動物源MRSA引起了醫(yī)學界的廣泛關(guān)注。在治療葡萄球菌感染時，無論是動物還是人，均使用抗生素。但隨著抗菌藥物的廣泛使用，細菌耐藥性日益嚴重，而且細菌耐藥性可在不同的物種之間傳播。目前在醫(yī)學上基于 MIC（Minimal Inhibitory Concentration）的治療方案可能會導致細菌中的突變亞群逐漸發(fā)展成為優(yōu)勢菌群，導致細菌發(fā)生耐藥。據(jù)細菌耐藥監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，一些抗生素對MRSA的最低抑菌濃度（MIC）向上漂移，細菌對其敏感性降低[3]。因此，如何合理應(yīng)用抗菌藥物、減少細菌耐藥發(fā)生、防止耐藥性在不同的物種之間傳播一直是人們的研究的重點。

Zhao和Drlica在1999年提出了防耐藥變異濃度（mutant prevention concentration，MPC）和突變選擇窗（mutant selection window，MSW）理論，該理論從控制感染和防止細菌耐藥突變株富集兩方面考慮，為減少細菌耐藥提供新的治療策略[4－5]。關(guān)于對 MPC的研究，國內(nèi)外學者開展了一些工作[6－7]，但主要集中在一些模式菌株和人醫(yī)臨床分離敏感菌株，未見對動物源細菌的報到，也未見對MRSA和MSSA的MPC比較研究，為此本研究測定了4種氟喹諾酮類藥物對動物源分離的MRSA和MSSA的MIC值和MPC值，比較各種氟喹諾酮類抗菌藥物對細菌耐藥突變體的選擇能力，為獸醫(yī)臨床優(yōu)化抗菌藥物給藥方案及限制耐藥突變體選擇性擴增提供依據(jù)，為獸醫(yī)臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 106株金黃色葡萄球菌來源于2010年4月至2010年10月河南科技學院獸醫(yī)院臨床分離株，其中牛源16株，豬源63株，禽源20株，犬源7株。經(jīng)美國臨床實驗室標準化組織（CLSI）推薦的頭孢西丁篩選試驗檢出21株為MRSA，85株 MSSA，凍存后－80。C保存，測定前復蘇。質(zhì)控菌株為ATCC29213（對苯唑西林敏感株）和ATCC43300（對苯唑西林耐藥株）均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 抗菌藥物 環(huán)丙沙星（批號：130451－200703，含量：84.9% ）、左氧沙星（批號：130455－200802，含量：97.2%）和加替沙星（批號：130518－200802，含量97.2%）標準品購自中國藥品生物制品檢定所；吉米沙星（含量：98.2% ）由新鄉(xiāng)佐今明藥業(yè)有限公司提供。苯唑西林標準品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 培養(yǎng)基 Muller－Hinton（M－H）肉湯和胰酶大豆瓊脂、胰酶大豆肉湯為北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司生產(chǎn)。

1.4 藥物敏感性 參考文獻[8]，使用瓊脂稀釋法測定85株金黃色葡萄球菌對苯唑西林的MIC值。判斷標準按照CLSI M100－S20中規(guī)定的標準，即金黃色葡萄球菌對苯唑西林的MIC值≥4μg／mL為耐藥，MIC值≤2μg／mL為敏感。同時嚴格按照CLSI推薦的瓊脂微量稀釋法對各種藥物的MIC進行測定，結(jié)果按2010版標準判讀。質(zhì)控跟隨每批實驗，以確保整個實驗的準確性。

1.5 MPC的測定 參照文獻報道的方法[9]，將單個菌落接種于20mL MH肉湯中過夜培養(yǎng)，3 000 r／min離心后，再懸浮在200mL MH肉湯中，震蕩培養(yǎng)6h離心后富集，將菌液濃度調(diào)整為3×1010CFU／mL。取100mL菌液均勻涂抹在含有抗菌藥物的MH平皿上，每個濃度3個平皿，使每個藥物濃度的細菌接種量約為1.5×1010CFU／mL。于37。C孵育72h測定，沒有細菌生長的最低抗菌藥物濃度即為MPC。

1.6 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)測定的MIC及MPC結(jié)果，計算 MIC90（藥物對90%菌株的 MIC）、MPC90、MPC／MIC比值（即選擇指數(shù)SI）；結(jié)合4種藥物的藥代動力學參數(shù)，推算給藥后血藥濃度Cmax＞MPC90和MIC90的時間。

2 結(jié) 果

2.1 MSSA的MIC和MPC的測定 環(huán)丙沙星、左氧沙星、加替沙星和吉米沙星4種喹諾酮類藥物對85株動物源性MSSA的MIC90值分別為1mg／L、0.5mg／L、0.25mg／L、0.125mg／L（見表1）。4種喹諾酮類藥物 MICs≥2mg／L的菌株數(shù)分別為環(huán)丙沙星5株，左氧沙星6株，加替沙星0株，吉米沙星1株。4種藥物的 MPC90值分別為4mg／L、2 mg／L、0.5mg／L、0.5mg／L。選擇指數(shù)即 MPC90／MIC90比值分別為4、4、2、4。由此可見加替沙星防耐藥突變能力優(yōu)于其它3種藥物。

2.2 MRSA的MIC和MPC的測定 4種喹諾酮類藥物對21株MRSA的MIC值、MPC值均比對MSSA的高，環(huán)丙沙星、左氧沙星、加替沙星和吉米沙星 MIC90值分別為8mg／L、8mg／L、2mg／L、2 mg／L，MPC90值 分 別 為 128mg／L、64mg／L、16 mg／L、8mg／L（見表2）。選擇指數(shù)（MPC90／MIC90）比值分別為16、8、8、4。由此可見在對 MRSA的防耐藥突變能力方面，吉米沙星要強于其它3種藥物。

2.3 4種氟喹諾酮類藥物對動物源 MRSA和MSSA的比較 結(jié)合藥代學參數(shù)，4種喹諾酮類藥物對MRSA和MSSA的MIC／MPC的比較結(jié)果見表3，可見對MSSA，環(huán)丙沙星的MPC＞Cmax，其余3種喹諾酮類藥物的MPC＜Cmax；對于MRSA，4種喹諾酮類藥物MPC均＞Cmax。結(jié)合血藥峰值和半衰期，推算出常規(guī)用藥推薦劑量的血藥濃度維持在MIC90和 MPC90以上的時間。對 MSSA來說，4種喹諾酮對MSSA的血藥濃度大于MIC90的時間順序為加替沙星＝吉米沙星＞左氧沙星＞環(huán)丙沙星，血藥濃度大于MPC90的順序為加替沙星＞吉米沙星＞左氧沙星＞環(huán)丙沙星。對MRSA而言，用藥后只有加替沙星血藥濃度＞MIC90維持8h，其余藥物按推薦劑量血藥濃度均達不到MIC90和MPC90值。

表1 4種喹諾酮類藥物對85株MSSA的MIC和MPC值的分布Tab.1 The MIC and MPC distribution of 85isolates of methicillin－susceptible S.aureus against four fluoroquinolones

表2 4種喹諾酮類藥物對21株MRSA的MIC和MPC值Tab.2 The MIC and MPC distribution of 21isolates of methicillin－resistant S.aureus against four fluoroquinolones

表3 4種喹諾酮類藥物對動物源MRSA和MSSA的比較Tab.3 Comparative fluoroquinolone activity with MRSA and MSSA isolated from animal

3 討 論

在養(yǎng)殖業(yè)上，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，導致大量耐藥菌出現(xiàn)，這些動物源耐藥菌可通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體，嚴重威脅人類的健康，因此如何有效預防細菌耐藥性的產(chǎn)生和減少這些耐藥菌從動物傳遞給人類，是目前研究的熱點。目前除了控制抗菌藥物的使用量、加強耐藥性的監(jiān)測和加強抗生素替代產(chǎn)品的研發(fā)等措施外，就是采用合理有效的治療方案。傳統(tǒng)的基于細菌MIC的治療方案，僅阻止大部分敏感菌的生長，而使耐藥突變株得到選擇性富集。因此，基于MPC理論的治療策略日益受到實驗室與臨床的重視，盡管國內(nèi)外的一些學者研究了部分FQ藥物對金黃色葡萄球菌的MPC，但其選用的菌株多為模式菌株或臨床分離的敏感菌株[6－7，9]。但在實際中，MRSA和MSSA的感染往往同時存在，故僅檢測敏感菌株的MPC／MIC不能有效指導臨床選擇藥物。本研究中測定了4種FQ藥物對動物源性MRSA和MSSA分離菌的MPC值，結(jié)合已有的藥代動力學參數(shù)，評價了不同F(xiàn)Q藥物限制耐藥突變株選擇的能力，為新的臨床用藥策略提供參考。

從實驗結(jié)果來看，85株 MSSA的MPC90的大小順序為加替沙星＝吉米沙星＜左氧沙星＜環(huán)丙沙星，而且加替沙星 MPC90／MIC90比值最小，所以對MSSA臨床分離株加替沙星防耐藥突變能力強于其它3種藥物，這與相關(guān)文獻報道一致[13]。結(jié)合藥物臨床推薦劑量的藥代動力學參數(shù)，加替沙星的血藥濃度Cmax＝4.2mg／L，是 MPC90的8.4倍，而加替沙星的T1／2為8－10h，按臨床推薦方法給藥，在整個給藥期間血Cmax均高于MPC90，因而單藥治療即能限制耐藥突變株的選擇。吉米沙星血藥濃度Cmax＝1.6mg／L，為 MPC90的3.2倍，其T1／2為7－8h，給藥期間血Cmax高于MPC90的時間為14h，因而單藥治療需要每隔12h加強給藥才能有效限制耐藥突變株的選擇。左氧沙星血藥濃度Cmax＝5.7mg／L，為 MPC90的2.85倍，其 T1／2為5－7h，給藥期間血Cmax高于MPC90的時間為6h，為了限制耐藥突變株的選擇，單藥治療時應(yīng)增加每日給藥次數(shù)，但隨著給藥次數(shù)增多，易誘導耐藥性產(chǎn)生。而環(huán)丙沙星的血藥濃度Cmax在給藥期間大部分時間位于MSW內(nèi)，單藥治療將很容易選擇出耐藥突變株，從而導致耐藥。這與臨床上使用環(huán)丙沙星治療后導致金黃色葡萄球菌對環(huán)丙沙星耐藥率快速增加相一致[9]。

21株MRSA的MPC90大小順序吉米沙星＜加替沙星＜左氧沙星＜環(huán)丙沙星，而且吉米沙星MPC90／MIC90比值最小，所以從理論上講對于MRSA臨床分離株吉米沙星限制耐藥突變株選擇的能力優(yōu)于其它3種藥物，但結(jié)合藥代動力學參數(shù)發(fā)現(xiàn)，按常規(guī)劑量給藥，4種藥物血藥濃度Cmax均達不到MPC90。單藥治療均易選擇出耐藥突變株而導致耐藥。但值得注意的是，用藥后加替沙星血藥濃度＞MIC90維持8h，預示在治療 MRSA感染中，4種氟喹諾酮類藥物中加替沙星可作為首先。

綜上所述，對動物源性MSSA，加替沙星防耐藥突變能力優(yōu)于吉米沙星、左氧沙星和環(huán)丙沙星，加替沙星和吉米沙星單藥能有效限制耐藥突變株的選擇，而左氧沙星和環(huán)丙沙星則不能。對動物源性MRSA，4種藥物單藥均不能有效限制耐藥突變株的選擇。但考慮到在動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中，不會對每個感染病例都測定MPC，建議在治療金黃色葡萄球菌感染時首選加替沙星，而不是籠統(tǒng)的使用氟喹諾酮類的任一種。有關(guān)聯(lián)合用藥與MPC之間的關(guān)系有待進一步深入研究。

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