扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠多器官損傷心肌組織炎性因子表達的影響*

★ 王丁超 常銀江 蘇秀平 王靜 張韌 陳曉敏 (．河南省濮陽市中醫(yī)院 濮陽45700;．河南省濮陽市人民醫(yī)院 濮陽45700)

膿毒癥(sePsis)是指微生物入侵機體致感染后，所導致的全身性炎癥反應綜合征。由膿毒癥導致的感染性休克、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ injury，MODS)，已成為臨床危重患者的重要死亡原因之一［1］。在膿毒癥多器官功能衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中炎癥反應起著重要的作用，大量炎癥因子的釋放，使機體出現(xiàn)了一系列全身反應，進而導致多器官功能衰竭，心臟是最常受累器官之一，心臟局部增加的炎癥因子是導致心功能障礙的重要因素［2，3］本實驗以膿毒癥大鼠為研究對象，通過觀察扶正敗毒顆粒對外周血白細胞計數(shù)、中性粒細胞及心肌炎性因子IL－1、TNF－α的影響，以闡明其對膿毒癥的抗炎及心肌保護作用可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

青年SD大鼠154只，清潔級，雌雄各半，鼠齡3－4月，體質(zhì)量(300±50)g，由河南實驗動物中心提供(動物質(zhì)量合格證號:scxk(豫)2009－0006)。

1.2 藥品、試劑與儀器

扶正敗毒顆粒，由濮陽市中醫(yī)院中藥制劑室提供，批號為20090605;烏司他丁，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號為S19990050。IL－1單克隆抗體(批號:BA0990)及TNF－α單克隆抗體(批號:BA0962)，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。PM－10AD型光學顯微鏡，Olympus optical Co．LTD產(chǎn)品;JA1203型電子天平，上海精科天平廠產(chǎn)品;XS－800i型自動血液分析儀，日本希森美康公司產(chǎn)品。

1.3 分組與模型的建立

將SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型對照組、扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組及扶正敗毒顆粒聯(lián)合烏司他丁聯(lián)合組(以下簡稱聯(lián)合組)，每組36只，另設假手術組10只。參考文獻［4，5］加以改良建立膿毒癥動物模型。以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠;待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸部皮膚常規(guī)備皮、消毒;于頸外側(cè)下頜至心臟的中點作1個約1 cm的橫切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)頸外靜脈;沿血管向近心端方向插入留置針約1 cm，將導管從留置針管與頸外靜脈夾孔中把心導管慢慢置入達右心房，結(jié)扎固定，導管末端經(jīng)皮下隧道從頸后中央引出并固定于皮膚;管內(nèi)注射125 U/mL肝素0．5 mL抗凝，插入置管針封閉導管;然后沿腹白線中段作3 cm切口，探查取出盲腸;用四號絲線距盲端1 cm處結(jié)扎，用12號針穿刺3孔，擠出少許糞便于腹腔內(nèi)，回納盲腸，分層縫合腹腔。假手術組的處理分別在頸部及腹部做一切口，縫合，然后按各時間點取材。手術過程中保持大鼠肛溫(37．0±0．5)℃，保持室溫(26±1)℃。

1.4 給藥方法

造模后第1日，假手術組、模型對照組、烏司他丁組用生理鹽水灌胃，扶正敗毒顆粒組、聯(lián)合組用扶正敗毒顆粒(36．8 mg/100g)灌胃(灌胃容積為1 mL/100g)，每日灌胃1次，連續(xù)7天，直至取材;此外，烏司他丁組、聯(lián)合組大鼠分別于造模后第1天腹腔內(nèi)注射烏司他丁(1萬U/kg)，假手術組、模型對照組、扶正敗毒顆粒組用同等容積的生理鹽水腹腔注射，每天1次，連續(xù)7天，直至取材。

1.5 檢測指標

1．5．1 外周血白細胞和中性粒細胞比率 取大鼠尾部靜脈血，用XS－800i自動血液分析儀自動分析計數(shù)外周血白細胞(×109·L－1)和中性粒細胞比率(%)。

1．5．2 臟器組織IL－1，TNF－α表達 檢測采用免疫組織化學SP法檢測。免疫組化染色結(jié)果分析方法如下:光鏡下觀察，在400倍視野下，細胞膜、細胞漿呈棕色為免疫組化陽性。以光鏡觀察，用Image－Pro Plus 5．1專業(yè)圖像采集與分析系統(tǒng)采集圖像，并進行半定量分析。每張切片隨機選取不重疊的5個視野拍照，測定其平均吸光度(A)及陽性細胞數(shù)，取其平均值代表各細胞因子的表達水平。

1．5．3 病理觀察 取心肌組織4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成4～6μm厚的切片，常規(guī)脫蠟、脫水，蘇木素－伊紅(HE)染色，脫水、透明、封片。光學顯微鏡觀察心肌組織病理形態(tài)學改變。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13．0統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()標準差(s)表示，組內(nèi)差異比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗。以P＜0．05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠外周血WBC計數(shù)、中性粒細胞比率的影響

模型組各時間點大鼠外周血白細胞計數(shù)和中性粒細胞比率較假手術組顯著升高(P＜0．01)。扶正敗毒顆粒組和烏司他丁組比模型組明顯降低(P＜0．05，P ﹤ 0．01)，以聯(lián)合 7d組的尤為顯著(P ＜0．01)。見表1。

表1 各組大鼠白細胞計數(shù)、中性粒細胞比率比較()

表1 各組大鼠白細胞計數(shù)、中性粒細胞比率比較()

注:與假手術組比較:*P＜0．05，＊＊P＜0．01;與模型對照組比較:#P ＜0．05，##P ＜0．01;與扶正敗毒顆粒組比較:△P ＜0．05，△△P ＜0．01;與 2d組比較:＊P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與 3d組比較:▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

組別 時間(天)動物數(shù)(只)白細胞計數(shù)(×109L－1)中性粒細胞比率(%)4．38 ±0．88 62．16 ±0．00模型對照組 2 6 12．07±1．27＊＊ 80．53±1．70＊＊3 6 15．88 ±1．78＊＊ 91．70 ±2．46＊＊7 6 14．58 ±1．57＊＊ 85．24 ±2．04＊＊▲扶正敗毒顆粒組 2 6 8．87 ±0．92 76．18 ±1．37 3 6 10．60 ±1．29## 82．35 ±1．69##7 6 9．17 ±1．25##＊＊▲▲ 73．21 ±2．26##＊＊▲▲烏司他丁組 2 6 8．25 ±0．77 77．06 ±1．60 3 6 9．33 ±1．11 80．39 ±1．45 7 6 6．75 ±1．76#△△＊＊▲▲ 72．86 ±2．27#△△＊＊▲▲聯(lián)合組 2 6 7．07 ±1．70 74．11 ±1．22#3 6 5．63 ±1．36## 70．26 ±1．94##7 6 4．98 ±0．98##△＊＊▲▲ 65．37 ±1．79##△＊＊▲▲假手術組6

2.2 心肌組織TNF－α、IL－1的表達變化

假手術組心肌組織少量TNF－α、IL－1陽性表達。模型對照組心肌組織TNF－α、IL－1表達明顯高于假手術組 (P＜0．05或P＜0．01)。與模型對照組對比，扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組的3、7天及聯(lián)合組各時間點TNF－α、IL－1陽性細胞表達明顯降低(P＜0．05或P＜0．01)。各藥物組3天時TNF－α、IL－1陽性細胞的表達均較2天時減弱，7天時的表達均較3天時顯著減弱(P＜0．05或P＜0．01)，以聯(lián)合7天組尤為顯著(P＜0．01)。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織TNF－α、IL－1陽性細胞表達變化(IOD，光密度單位)()

表2 各組大鼠心肌組織TNF－α、IL－1陽性細胞表達變化(IOD，光密度單位)()

注:與假手術組比較:*P＜0．05，＊＊P＜0．01;與模型對照組比較:#P ＜0．05，##P ＜0．01;與扶正敗毒顆粒組比較:△P ＜0．05，△△P ＜0．01;與 2d組比較:＊P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與 3d組比較:▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

組別 時間(天)動物數(shù)(只) 心肌組織TNF－α 心肌組織IL－1 2．46 ±1．12 1．97 ±1．35模型對照組 2 6 19．66 ±1．12 19．38 ±1．26 3 6 12．59 ± 2．3* 12．37 ± 1．22＊＊7 6 10．13 ±1．08＊＊▲ 10．38 ±2．38＊＊＊▲扶正敗毒顆粒組 2 6 12．77 ±1．12## 13．23 ±2．95 3 6 9．68 ± 1．54## 10．72 ±2．31#7 6 8．01 ±2．27##＊＊▲ 8．33 ±1．58#＊▲烏司他丁組 2 6 14．23 ±2．53# 15．63 ±2．63#3 6 10．93 ±1．46# 10．29 ±2．99＊7 6 9．56 ±1．41##＊▲ 9．11 ±1．46＊＊▲聯(lián)合組 2 6 7．49 ±1．77## 9．22 ±1．13##3 6 6．93 ± 1．88## 8．16 ±2．24##△7 6 5．88 ±1．66##△△＊＊▲▲ 6．24 ±2．32##假手術組6△△＊＊▲▲

2.3 病理改變

光鏡下假手術組心肌組織未見明顯的病理改變，心肌纖維排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，心肌細胞正常，心肌間質(zhì)無充血、水腫，未見炎性細胞。模型組大鼠隨著時間的延長，心肌逐漸出現(xiàn)病理改變，心肌纖維斷裂，心肌組織排列紊亂，血管充血出血，心肌細胞間見成堆血細胞，心肌細胞腫脹或皺縮，胞核變形，心肌間質(zhì)充血水腫，炎癥細胞浸潤，尤以3天組最明顯。實驗藥物組心肌細胞損害較輕，心肌組織稍紊亂，可見有少量炎癥細胞浸潤，細胞核未見明顯變化，較同時點模型組相比病理變化減輕，尤以聯(lián)合7天組最明顯。

3 討論

膿毒癥屬中醫(yī)學“傷寒”、“溫病”等范疇。由于邪毒入侵或各種創(chuàng)傷導致正邪交爭、正氣耗傷、邪毒阻滯而發(fā)病。正氣虧虛、濁毒內(nèi)蘊、絡脈瘀滯是膿毒癥的主要病理機制之一。本病的病機特點為本虛標實，本虛以氣虛為主勢以緩，標實則以濁毒(熱毒、瘀毒、濁毒)為主勢以急，虛、瘀、毒交互影響，形成惡性循環(huán)。故治療則以清熱解毒、降濁化瘀為主，兼顧益氣扶正。據(jù)此擬中藥復方扶正敗毒顆粒(由人參、生大黃、水牛角、生地黃、麥冬、玄參、石膏、知母、黃連、冰片等組成)治療。諸藥配伍，共奏解毒降濁、益氣化瘀之功效。本研究表明，經(jīng)過應用扶正敗毒顆粒，膿毒癥大鼠外周血白細胞總數(shù)及中性粒細胞比例降低，扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠具有明顯的抗炎作用。

膿毒癥最主要的危害是引發(fā)多器官障礙綜合征(MODS)導致死亡，其本質(zhì)在于由眾多細胞因子和細胞黏附分子參與的失控性炎癥反應及炎癥反應/抗炎反應失衡［6］。炎癥瀑布效應在誘導膿毒癥心肌損害中占主要地位。膿毒癥能夠引起TNF－α、IL－1等一系列炎癥介質(zhì)釋放。目前研究［7］認為循環(huán)中以及心肌組織產(chǎn)生的炎癥因子如TNF－α、IL－1在膿毒癥心肌損害的發(fā)生發(fā)展中起重要作用:早發(fā)型心肌損害主要由TNF－α、IL－1引起。本研究顯示模型組大鼠心肌組織TNF－α、IL－1表達水平均較假手術組明顯上調(diào)，表明膿毒癥能刺激心肌細胞，激活炎癥信號通路，誘導炎癥反應。因此抑制過度炎癥反應、重建炎癥反應和抗炎反應間的平衡是膿毒癥治療的重點。本實驗結(jié)果顯示，扶正敗毒顆粒能夠降低組織炎性因子TNF－α，IL－1表達水平，提示扶正敗毒顆粒通過降低心肌組織中炎性細胞因子TNF－α，IL－1含量，進而減輕膿毒癥大鼠心肌組織損傷和降低死亡率。

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