替比夫定治療前后乙型病毒性肝炎后肝硬化患者T淋巴細胞嗜銀蛋白含量變化的研究

常青山，宮航宇(大連市第六人民醫(yī)院綜合內(nèi)科，遼寧大連 116031)

現(xiàn)階段多項研究表明乙肝后肝硬化患者肝細胞損傷是由宿主免疫損傷和乙型肝炎病毒(HBV)共同作用的結(jié)果，其中在肝細胞損害中起主要作用的是細胞免疫，而T細胞又在其中發(fā)揮了主要作用，T細胞活性的降低以及亞群的紊亂可能是導(dǎo)致人體HBV不能清除、肝細胞損傷及發(fā)生慢性化的主要原因，如何糾正這種免疫失衡已成為當前世界的一道難題。研究表明，核仁形成區(qū)嗜銀蛋白(AgNORs)的變化是核糖體DNA(rDNA)、核糖體RNA(rRNA)活性變化的標志之一，進而可在一定程度上反映T淋巴細胞活性的變化。本文通過對50例乙型病毒性肝炎后肝硬化患者替比夫定治療前后分別進行了Child-Pugh分級計分及外周血AgNORs檢測，通過各檢查指標的比較來探討替比夫定對肝硬化患者人體細胞免疫功能及病情進展的影響。

1 材料

1.1 病例選擇

收集2011年1月1日—2011年8月1日就診的乙型病毒性肝炎后肝硬化住院患者50例，其中男性27例，女性23例;年齡30～62歲，平均42.2歲;肝硬化病程2～32 a。

肝硬化診斷依據(jù)2000年9月西安會議制定的診斷標準［1］。入選標準:(1)患者有相符合的臨床表現(xiàn)，經(jīng)彩超、CT、胃鏡等輔助檢查綜合診斷;(2)患者血清乙型病毒性肝炎標志物陽性，HVB定量陽性，并除外合并丙肝、丁肝及血吸蟲感染、酒精性肝病等;(3)排除其他影響免疫功能的疾病:如艾滋病病毒(HIV)感染、肝癌、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病例;(4)病情重，估計生存期＜3個月。

實驗患者HBV標志物陽性病程為3～44 a，平均15.5 a，且未經(jīng)抗乙型肝炎病毒治療，近期未應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑治療。50例患者替比夫定治療前36例出現(xiàn)并發(fā)癥，其中腹水18例、肝性腦病10例、消化道出血8例;無并發(fā)癥14例。正常對照組40例，男性22例，女性18例，均為我院健康體檢者。

1.2 試劑

HBV-DNA定量檢測試劑盒(上海復(fù)星公司生產(chǎn));肝功能生化試劑盒(上?？迫A公司生產(chǎn));三色單抗試劑;銀染液(北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn));固定液和配套試劑(北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn));RPM-1640細胞培養(yǎng)液(北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

1.3 儀器

ABI 7500型實時PCR檢測系統(tǒng)(美國ABI公司生產(chǎn));KL型腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)(北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn));OLYMPLIS AU640全自動生化分析儀(日本OLYMPLIS光學(xué)株式會社生產(chǎn))。

2 方法

2.1 治療方法

治療組在常規(guī)治療(用維生素C、還原型谷胱甘肽做常規(guī)保肝治療)的基礎(chǔ)上口服替比夫定600 mg/d，療程6個月，治療期間未應(yīng)用其他抗病毒藥及調(diào)節(jié)免疫藥治療，出現(xiàn)并發(fā)癥(腹水、肝性腦病、消化道出血、低蛋白血癥)者給予相應(yīng)對癥治療，出院患者除替比夫定、利尿藥外不應(yīng)用其他藥物，對照組無治療。

2.2 標本采集

分別于替比夫定治療前及治療后6個月抽取患者空腹肘部靜脈血檢測以下指標:(1)采用KL型腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)及配對試劑檢測外周血T細胞AgNORs。(2)采用實時定量PCR法檢測 HBV-DNA，嚴格按照試劑說明書步驟進行。(3)采用全自動生化分析儀檢測血清白蛋白(ALB)及總膽紅素(TBIL)。(4)采用全自動血凝儀檢測凝血時間(PT)。(5)參照文獻［2］將實驗患者肝性腦病、腹水、血清總膽紅素、血清白蛋白濃度、凝血酶原時間5個指標的不同程度進行計分。(6)HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率計算公式:HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率=治療后轉(zhuǎn)陰病例/治療總病例。(7)統(tǒng)計學(xué)處理:使用 SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析，所得數(shù)據(jù)以表示，計量資料的組間比較采用t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 替比夫定治療乙型病毒性肝炎后肝硬化患者HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率及肝功能Child-Push分級評分的改變

替比夫定治療6個月后48例患者HBV-DNA陰轉(zhuǎn)，2例未陰轉(zhuǎn)，陰轉(zhuǎn)率為96%。替比夫定治療6個月后與治療前比較，白蛋白水平明顯升高(P＜0.05)，總膽紅素水平明顯下降(P＜0.05)，凝血酶原時間明顯減少(P＜0.05)，Child-Push分級評分明顯升高(P＜0.05)，見表1。

表1 替比夫定治療前與治療6個月后患者血清ALB、TBIL、PT水平和Child-Push評分比較()Tab 1 ALB，TBIL and PT levels and Child-Push scores at 0 and 6 months of treatment with telbivudine()

表1 替比夫定治療前與治療6個月后患者血清ALB、TBIL、PT水平和Child-Push評分比較()Tab 1 ALB，TBIL and PT levels and Child-Push scores at 0 and 6 months of treatment with telbivudine()

組別 病例數(shù) ALB/(g/L)TBIL/(mmol/L) PT/s Child-Push評分/分50 30.2±6.7 58.8±22.9 15.8±3.4 9.6±2.2治療后治療前50 36.3±6.9 33.1±21.8 14.3±2.6 8.0±2.0

3.2 替比夫定治療前及治療6個月后AgNORs水平的變化

與正常對照組比較，替比夫定治療前后AgNORs均降低(P＜0.05)，與治療前比較，替比夫定治療后AgNORs明顯升高(P ＜0.05)，見表2。

表2 替比夫定治療前與治療6個月后患者T淋巴細胞亞群及AgNORs水平的變化()Tab 2 Change in T lymphocyte subsets and argyrophilic nucleolar organizer region protein(AgNORs)content at 0 and 6 months of treatment with telbivudine()

表2 替比夫定治療前與治療6個月后患者T淋巴細胞亞群及AgNORs水平的變化()Tab 2 Change in T lymphocyte subsets and argyrophilic nucleolar organizer region protein(AgNORs)content at 0 and 6 months of treatment with telbivudine()

AgNORs/%正常對照組組別 病例數(shù)40 7.45±0.58肝硬化組治療前 50 5.02±0.88肝硬化組治療后50 5.88±1.16

4 討論

T淋巴細胞是一種免疫活性細胞，它在細胞免疫乃至整個機體免疫系統(tǒng)中都有著重要的地位，細胞核的核仁由多個組成區(qū)(NORs)構(gòu)成，其中包含有 rDNA，并通過它轉(zhuǎn)錄合成rRNA等物質(zhì)，組成區(qū)的局部可以用銀染的方法顯示，通過研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)主要成分為核仁轉(zhuǎn)錄因子(UBF)、核仁非組蛋白B23(簡稱B23)及核糖核酸聚合酶Ⅰ亞單位等非組蛋白，統(tǒng)稱為AgNORs［3］。目前研究認為UBF為參與調(diào)節(jié)rDNA轉(zhuǎn)錄的蛋白，而B23參與核糖體前RNA(pre rRNA)的轉(zhuǎn)錄、加工及裝配，而核糖核酸聚合酶Ⅰ亞單位能夠催化rRNA的合成，這些研究表明AgNORs是具有輔助轉(zhuǎn)錄活性的非組蛋白。另外細胞周期不同，AgNORs的含量也不同，在細胞處于相對靜息的時期，AgNORs的含量相對較低;而在細胞活躍，進行DNA的復(fù)制，AgNORs含量顯著升高［3］，這表明隨著DNA含量的增加，AgNORs的含量同時也在增加，故AgNORs含量的變化可反映rDNA、rRNA的活性變化，進而在一定程度上也反映了T淋巴細胞活性的變化。故通過檢測外周血T細胞AgNORs的含量可以判斷機體的免疫狀態(tài)。

實驗觀察替比夫定治療前及治療6個月后HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率，肝臟 Child-Push評分的變化，與 Yao等［4］研究結(jié)果一致，該結(jié)論表明替比夫定可迅速抑制HBV復(fù)制，改善乙型病毒性肝炎后肝硬化患者肝功能。長期應(yīng)用可明顯改善肝細胞壞死的嚴重性改變，并可減輕和阻止肝臟纖維化的進展，減少肝硬化并發(fā)癥及肝癌的發(fā)生率。在替比夫定治療6個月后AgNORs明顯升高，這與國外慢性乙肝替比夫定治療相關(guān)報道相一致［5］。該研究結(jié)果表明替比夫定可以改善乙型病毒性肝炎后肝硬化患者的T細胞免疫活性。何庭宇等認為在HBV感染的不同時期，患者的肝損害與細胞免疫有密切相關(guān)性［6］，肝臟的破壞程度可以影響到細胞免疫功能，考慮其原因有可能是:肝功能受損、低白蛋白血癥、營養(yǎng)不良均可以出現(xiàn)免疫功能異常，各種細胞因子以及多種致病因子不同程度作用于T細胞亞群及其 rDNA活性，表現(xiàn)為 AgNORs活性受到抑制及CD4+輔助性T淋巴細胞功能減弱，CD8+抑制性T細胞功能過度活化。本實驗患者在替比夫定治療后，肝功能好轉(zhuǎn)十分顯著，肝硬化患者病情明顯減輕，從而使患者T淋巴細胞免疫活性有所恢復(fù)，整體T細胞免疫反應(yīng)功能增強?；谝陨希姹确蚨ǜ纳埔倚筒《拘愿窝缀蟾斡不颊逿細胞免疫活性機制之一可能是肝功能恢復(fù)，白蛋白上升，肝硬化各種并發(fā)癥減少所致，有待于進一步探討。AgNORs測定可以反映肝硬化患者細胞免疫功能，同樣能夠作為肝硬化患者病情進展以及預(yù)后判定的重要指標。實驗患者通過替比夫定治療后，HBV陰轉(zhuǎn)率十分明顯，病毒復(fù)制被迅速抑制，使乙肝病毒對機體的免疫壓力降低，從而使各抑制因素得以減輕，以至于患者T細胞免疫活性有所恢復(fù)，整體T細胞免疫反應(yīng)功能增強，故替比夫定糾正乙型病毒性肝炎后肝硬化患者T細胞免疫功能紊亂又一機制有可能是替比夫定快速使HBV復(fù)制減弱，病毒對機體的免疫抑制降低所致［7］，試驗表明T細胞AgNORs測定可以作為判斷替比夫定抗病毒治療療效的一項重要指標。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用替比夫定雖然有風(fēng)險，但帶給患者的益處較顯著，通過6個月的治療后，HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率較高，患者的Child-Push分級評分下降，T細胞免疫活性得到恢復(fù)，肝硬化并發(fā)癥減少，臨床癥狀明顯改善，即有臨床實用價值，值得廣泛推廣。由于病例數(shù)量相對較少，觀察時間短，對于延長替比夫定治療療程對乙型病毒性肝炎后肝硬化患者T細胞免疫功能的影響尚不明確，有待于今后進一步研究。

［1］中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會.病毒性肝炎防治方案［J］.中華肝臟病雜志，2000，6(8):324-329.

［2］葉任高.內(nèi)科學(xué)［M］.5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002;460-470.

［3］Sirri V，Roussel P，Hernandez-Verdun D.The AgNOR proteins:qualitative and quantitative changes during the cell cycle［J］.Micron，2000，31(2):121-126.

［4］Yao FY，Bass NM.Lamivudine treatment in patients with severely decompensated cirrhosis due to replicating hepatitis B infection［J］.J Hepatol，2000，33(2):301-307.

［5］Mizukoshi E，Sidney J，Livingston B，et al.Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase［J］.J Immunol，2004，173(9):5863-5871.

［6］Kweon YO，Goodman ZD，Dienstag JL，et al.Decreasing fibrogenesis:an immunohistochemical study of paired liver biopsies following lamivudine therapy for chronic hepatitis B［J］.J Hepatol，2001，35(6):749-755.

［7］Lai CL，Yuen MF.Profound suppression of hepatitis B virus replication with lamivudine［J］.J Med Virol，2000，61(3):367-373.