運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食性肥胖大鼠棕色脂肪組織線粒體形態(tài)和動(dòng)力學(xué)的影響及可能機(jī)制的研究

歐秀伶，于寶明，孫 劍

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平不斷的提高，飲食結(jié)構(gòu)生活習(xí)慣發(fā)生了很大的改變，肥胖癥呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)，肥胖及其發(fā)病機(jī)制的研究也受到廣泛關(guān)注［1－2］。棕色脂肪與能量平衡有關(guān)，棕色脂肪具有產(chǎn)熱功能，對(duì)維持能量平衡具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠棕色脂肪組織明顯減少，且棕色脂肪組織細(xì)胞存在線粒體損傷、能量代謝異常［3］。研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)能夠有效地控制脂肪的合成，增加脂肪的供能，促進(jìn)脂肪的消耗［4］。本研究通過觀察有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后肥胖大鼠棕色脂肪組織線粒體形態(tài)變化，探討導(dǎo)致肥胖大鼠棕色脂肪組織線粒體形態(tài)以及動(dòng)力學(xué)變化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 將34 只3周齡SD 健康雄性大鼠隨機(jī)分為2 組:正常組8 只，斷乳后給予普通飼料喂養(yǎng)，在第8周時(shí)選取體重超出正常對(duì)照組平均體重為20%的大鼠16 只，再隨機(jī)分為肥胖對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，其中肥胖對(duì)照組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組給以普通飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，每天采用無負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)1 h，每周5 天。所有大鼠均在實(shí)驗(yàn)第16周時(shí)處死。

普通飼料構(gòu)成為常規(guī)配方。高脂肪飼料配方如下:每100 克普通飼料中加入全脂奶粉15 g，豬油5 g，黃肚豆15 g，雞蛋黃50 g，魚肝油10 滴，牛膽酸納0.5 g［3］。大鼠自由飲食攝食，自然晝夜采光。

1.2 樣本的采集 隔夜禁食后將大鼠稱重(BW)，麻醉，斷頭處死，迅速取肩胛間區(qū)棕色脂肪組織(BAT)，睪周白色脂肪組織(WAT)，稱重后，用銳利眼科剪將棕色脂肪組織標(biāo)本剪成2 mm ×2 mm ×2 mm 左右的脂肪組織方塊，依次用40℃的2.5%的戊二醛專用電鏡固定液固定，0.1 mol/LPBS 緩沖液洗滌2 次，1%鋨酸后固定30～60 min，常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋、超薄切片、鈾鉛染色，電鏡觀察線粒體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu);留取部分脂肪組織于－80℃冰箱保存，進(jìn)行NYGGF4 mRNA 和M fn1、M fn2 及Drp1 蛋白表達(dá)的測(cè)定。

1.3 NYGGF4mRNA 的表達(dá) 采用Trizol 一步法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)凝膠電泳顯示28 S、18S 清晰條帶2條，測(cè)定OD260/OD280比值＞1.8。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后采用熒光定量RT－PCR 法檢測(cè)棕色脂肪細(xì)胞中NYGGF4mRNA 表達(dá)水平。從NCBI 的nucleotide 中查得目的基因和內(nèi)參照基因，聯(lián)系上海博亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)上下游引物。引物序列如下:NGGF4 上游序列:5’CCTGTCAGACCCCACTTTC 3’，NGGF4 下游序列:5’CAGCCCACTGTTTTCCAAAT3;β－ actin 上游序列:5’TCACCCACACTGTGGCCATGT AGGA 3’，β－actin 下游序列:5’CAGGGGAACCGGTCATTGCCAATGG3’。退火溫度均為55.4 攝氏度。采用CT 法計(jì)算NYGGF4mRNA 相對(duì)表達(dá)量。目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量=2CT(參考基因)－ CT(目的基因)。

1.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 應(yīng)用Western blot技術(shù)測(cè)M fn1、M fn2 及Drp1 蛋白的表達(dá)。各取100 mg 棕色脂肪組織剪碎并于玻璃勻漿器充分勻漿，加3～5 倍體積的組織裂解液于冰盒中吹打30 min，4℃下12 000rpm 離心10 min，取上清液。BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取30 微克總蛋白加上樣緩沖液煮沸5 min 后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜放入50 g/L脫脂奶粉中，室溫下封閉1 h，將稀釋好的一抗加入大小合適的塑料袋中，加入膜、去除氣泡40℃封好袋口，室溫反應(yīng)4 h 后40℃過夜，HRP 標(biāo)記的二抗室溫作用1 h，化學(xué)發(fā)光后顯影、定影。掃描顯影條帶，記錄其灰度值。以β－ actin 為內(nèi)源性參照，計(jì)算Mfn1 蛋白、Mfn2 蛋白、Drp1 蛋白相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。取對(duì)照組均數(shù)為1，將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 10.0 軟件分析，全部數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)，選擇Homogeneity－of－variance 顯示方差齊性，選擇Turkey 比較各組間差異，P ＜0.05 表示組間差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 體重、棕色脂肪組織(BAT)、白色脂肪組織(WAT)的比較 與正常對(duì)照組比較，肥胖組大鼠體重顯著高于對(duì)照組，BAT 顯著低于對(duì)照組，WAT 與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與肥胖組相比，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠體重、WAT 顯著下降，BAT 與肥胖組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 大鼠體重、褐色脂肪組織、白色脂肪組織的比較

2.2 棕色脂肪組織線粒體形態(tài)變化 透射電鏡發(fā)現(xiàn)，肥胖組大鼠線粒體體積變小、數(shù)量明顯減少，線粒體嵴斷裂、減少、消失，部分線粒體腫脹，甚至呈空泡狀(1A);有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，肥胖組大鼠(1B)線粒體形態(tài)接近于正常對(duì)照組(1C)，表現(xiàn)為線粒體形態(tài)基本正常，無明顯腫脹、皺縮，膜結(jié)構(gòu)完整，清晰可見(圖1)。

圖1 棕色脂肪組織線粒體形態(tài)變化

2.3 脂肪細(xì)胞NYGGF4 基因的表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，肥胖組大鼠NYGF4mRNA 表達(dá)顯著增高，灰度值明顯高于正常對(duì)照組，差異具有非常顯著性;與肥胖組相比，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠NGGF4mRNA 表達(dá)顯著降低，灰度值明顯低于肥胖組，差異具有非常顯著性;與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2、表2)。

圖2 NYGF4mRNA 在大鼠脂肪組織中的表達(dá)

表2 大鼠NYGGF4mRNA、Mfn1 蛋白、Mfn2蛋白、Drp1 蛋白表達(dá)的比較

2.4 脂肪細(xì)胞中Mfn1、Mfn2、Drp1 蛋白的表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，肥胖組大鼠脂肪細(xì)胞中Mfn1 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P ＜0.05)，Mfn2 和Drp1 蛋白表達(dá)水平無顯著變化;有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠脂肪細(xì)胞中Mfn1 蛋白表達(dá)水平較肥胖組大鼠顯著降低，差異具有非常顯著性;與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、表3)。

圖3 C Drp1 蛋白在大鼠脂肪組織中的表達(dá)

3 討論

人體內(nèi)存在棕色和白色兩種脂肪，白色脂肪堆積在皮下，負(fù)責(zé)儲(chǔ)存多余熱量;棕色脂肪負(fù)責(zé)分解引發(fā)肥胖的白色脂肪，將后者轉(zhuǎn)化成二氧化碳、水和熱量，它可以加快人體新陳代謝，促進(jìn)白色脂肪消耗［5］。

NYGGF4 基因是最近發(fā)現(xiàn)的在肥胖兒童脂肪組織中高表達(dá)的基因，其在脂肪細(xì)胞中過表達(dá)，顯著降低了胰島素刺激的葡萄糖攝取，表明NYGGF4 基因可以降低脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗(IR)［6］。目前，關(guān)于IR 的發(fā)生機(jī)制存在許多學(xué)說，線粒體功能障礙學(xué)說是近年來提出的新理論［7］，主要是指線粒體損傷和線粒體密度下降引發(fā)脂肪酸代謝障礙或功能低下，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能受損、線粒體膜電位降低，不僅產(chǎn)能物質(zhì)(ATP)減少，而且活性氧(ROS)產(chǎn)生增多，從而影響胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致胰島素抵抗。已知線粒體形態(tài)與其功能、代謝活動(dòng)密切相關(guān)［8］。大量研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)能調(diào)節(jié)代謝功能，增加熱能消耗，促進(jìn)脂肪分解［9］。

本研究對(duì)肥胖大鼠棕色脂肪組織中線粒體的形態(tài)和數(shù)量進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠脂肪細(xì)胞的線粒體體積變小，數(shù)量明顯減少，線粒體嵴斷裂、減少、消失，部分線粒體腫脹，甚至呈空泡狀等形態(tài)學(xué)異常，提示肥胖大鼠線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能存在損傷;有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，肥胖組大鼠肥線粒體形態(tài)接近于正常對(duì)照組，表現(xiàn)為線粒體形態(tài)基本正常，無明顯腫脹、皺縮，膜結(jié)構(gòu)完整，清晰可見;并且白色脂肪組織顯著減少，與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

線粒體是高度動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，其形態(tài)不斷發(fā)著融合與分裂變化。線粒體形態(tài)可以呈橢圓形、長(zhǎng)管狀、網(wǎng)絡(luò)狀，并且數(shù)量在各種形態(tài)間保持動(dòng)態(tài)平衡［10－11］。該現(xiàn)象與現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的一些線粒體形態(tài)及動(dòng)態(tài)相關(guān)基因密切相關(guān)，如Mfn1、Mfn2、Drp1 基因。本研究通過熒光定量PCR 法，檢測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后肥胖大鼠脂肪細(xì)胞中NYGGF4 基因、Mfn1 蛋白、Mfn2蛋白、Drp1 蛋白的表達(dá)水平，其中NYGGF4 基因以及Mfn1 蛋白在肥胖大鼠脂肪組織中顯著上調(diào);Mfn2 蛋白、Drp1 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，NYGGF4 基因以及Mfn1 蛋白在肥胖大鼠脂肪組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào);與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Mfn 蛋白在哺乳動(dòng)物中存在2種分子，Mfn1 蛋白和Mfn2 蛋白。在線粒體融合過程中發(fā)揮著協(xié)同作用［12］，其中Mfn1 蛋白主要在融合的前期促進(jìn)線粒體間的彼此結(jié)合;Mfn2 主要在融合反應(yīng)的后期起作用，如促進(jìn)線粒體融合，利于線粒體內(nèi)膜對(duì)接等。本結(jié)果顯示，肥胖大鼠脂肪組織中NYGGF4mRNA 顯著上調(diào)，Mfn1 蛋白的表達(dá)水平顯著升高;有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，肥胖組大鼠脂肪組織中NYGGF4mRNA、Mfn1 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，說明了NYGGF4mRNA 可能通過上調(diào)Mfn1 蛋白的表達(dá)水平，從而部分影響線粒體形態(tài)及動(dòng)力學(xué)。

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