益氣活血方對大鼠缺血心肌血管新生及HGF影響的研究*

胡國恒 胡 哲 盛 望 陳勵競

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南省湘潭市中心醫(yī)院，湖南 湘潭 411100）

中藥益氣活血方對冠心病心絞痛具有良好的療效。本研究用免疫組織化學法檢測大鼠缺血心肌微血管計數(shù)（MVC）和微血管密度（MVD）及肝細胞生長因子（HGF）蛋白表達，進一步闡明益氣活血方保護缺血心肌細胞、增進缺血心肌血管新生機制，為缺血性心臟病的中醫(yī)藥治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 益氣活血組方（湖南中醫(yī)藥大學附屬一醫(yī)院自制藥）其藥物成分：黃芪1000 g，當歸200 g，川芎500 g，丹參500 g。麝香保心丸：批準文號為國藥準字Z31 020068；生產廠商為上海和黃藥業(yè)有限公司。

1.2 試劑與食品 大鼠HGF 試劑盒（上海繼錦化學科技有限公司）；免疫組化染色試劑盒（北京中杉生物技術有限公司）；HGF 多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司）；SABC 試劑盒（SA1022）（武漢博士德生物工程公司）；DAB 顯色劑試劑盒（AR1022）（武漢博士德生物工程公司）等。DH-140 動物人工呼吸機（浙江醫(yī)科大學醫(yī)療儀器實驗廠產品）；四道生理記錄儀（成都儀器廠產品）；CS-Ⅵ型攤片烤片機（湖北孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；MIAS 醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（北航公司產品）等。

1.3 實驗動物 健康雄性SD 大鼠32 只，體質量（230±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.4 造模方法 大鼠飼養(yǎng)1 周后造模，方法依據(jù)文獻報道［1］的方法進行。以1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，置于手術臺，四肢皮下連接心電圖電極，氣管插管，連接空氣呼吸機；于胸骨左旁第3～4 肋間切開皮膚，長約1 cm，逐層分離皮下組織、肌肉，暴露心臟及大血管根部，切開心包，輕擠大鼠胸廓，將心臟擠出，距左冠狀動脈起點約2 mm 處用零號醫(yī)用縫合線結扎血管，逐層關胸?；謴痛笫笞灾骱粑?，撥出氣管內插管，手術過程中分開胸后、縫針后、結扎后和關胸后4個點記錄心電圖變化。以心電圖ST 段的改變及左室前壁向外膨脹發(fā)紺為結扎成功標志。術后腹腔注射青霉素8萬U/只×3 d 以抗感染。

1.5 分組及給藥 造模成功后雄性SD 大鼠32 只完全隨機方法分成4 組：假手術組、心肌梗死模型組、麝香保心丸組和益氣活血方組，每組各8 只。于術后24 h灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14 d。假手術組、模型組均予蒸餾水10 mL/kg 灌胃，麝香保心丸組灌服等劑量藥物（12.13 mg/Kg），益氣活血方組灌服藥液（含益氣活血方生藥3.95 g/kg），末次給藥后禁食24 h，不禁水，腹主動脈取血后處死大鼠，留心臟標本。飼養(yǎng)過程中模型組死亡2 只，麝香保心丸組1 只。

1.6 心梗邊緣區(qū)MVC 及MVD 指標測量方法 用CD34單克隆抗體免疫組化染色后，血管內皮細胞被染成棕黃色。微血管判斷標準：按參考文獻方法［2-3］以CD34的表達來標記血管內皮細胞，凡是染成棕黃色單個內皮細胞或內皮細胞簇均作為一個血管計數(shù)，凡管腔大于8個紅細胞大小、帶有較厚肌層的血管區(qū)域的血管均不計數(shù)。具體方法為：先在40×視野下找到心梗邊緣區(qū)，選取微血管密度最高的區(qū)域，然后在400×視野下（圖像分析系統(tǒng)所取的視野）計數(shù)大鼠心梗邊緣區(qū)新生MVC，并用圖像分析系統(tǒng)測定其MVD，每張切片隨機選取5個視野，分別測定其MVC，MVD，取平均值作為本例大鼠的MVC，MVD 值。

1.7 免疫組織化學測定HGF 蛋白表達 光鏡下觀察，陽性染色細胞胞漿或胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。采用IPP6.0 醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，每個組每個時間點分別選取5 張切片，每張切片隨機選取5個視野，測定陽性著色累積光密度（IOD）值，對HGF 進行圖像分析。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以表示，采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠心肌梗死面積比較 見表1。益氣活血方組及麝香保心丸組心肌梗死面積較模型組明顯縮小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌梗死面積（IS）和缺血心肌HGF 蛋白表達比較（±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積（IS）和缺血心肌HGF 蛋白表達比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2 大鼠缺血心肌微血管計數(shù)和微血管密度的比較見表2。益氣活血方組及麝香保心丸組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠缺血心肌微血管計數(shù)（MVC）和微血管密度（MVD）比較（±s）

表2 各組大鼠缺血心肌微血管計數(shù)（MVC）和微血管密度（MVD）比較（±s）

2.3 大鼠缺血心肌HGF 蛋白表達的比較 見表1。在光顯微鏡下，各組大鼠心肌組織可見棕黃色蛋白表達。模型組與假手術組比較，HGF 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；益氣活血組方組及麝香保心丸組與假手術組比較，HGF 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；益氣活血方組與模型組比較，HGF 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；益氣活血方組與麝香保心丸組比較，HGF 蛋白表達有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

冠心病的基本病機為氣虛血瘀，病性屬本虛標實。《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》云“陽微陰弦，即胸痹而痛”。陽微即本虛，陰弦即標實。王清任在《醫(yī)林改錯》中指出“元氣既虛，必不能達血管，血管無氣必停留而瘀”。氣為血之帥，血為氣之母，心氣虧虛，運血無力，致心脈瘀阻，遂發(fā)為胸痹心痛。血瘀則脈絡不通，不通則痛，是以氣虛為本，血瘀為標，故證屬本虛標實。唯有補氣活血并用，方能氣助血行，瘀去脈利。擬創(chuàng)益氣活血方，益氣活血，通絡止痛。全方由黃芪、當歸、丹參、川芎諸藥組成。方中重用黃芪為君，溫陽補氣，氣盛則血行，具有增強機體抵抗力、調節(jié)免疫、促進抗體合成保護心腦血管系統(tǒng)等諸多作用。在心血管系統(tǒng)方面，其通過清除自由基、保護細胞結構及抗凋亡保護心肌［4-5］。當歸補血活血，具有擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、降低心肌耗氧量、改善微循環(huán)和抗凝血、抗血栓形成等諸多作用［6］。丹參活血祛瘀，通絡止痛，其化學成分丹參酮、丹參素、丹參酚等具有抗動脈粥樣硬化，抗血栓形成的作用，能促進心肌缺血或損傷的恢復，縮小心肌梗死范圍［7-8］。川芎具有擴張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量，制血小板凝集，預防血栓形成，降低心肌的耗氧量，減輕心肌缺血再灌注損傷等作用［9］。三藥共為佐藥。諸藥合用，使痹阻之心脈得以暢通，諸癥自除。

肝細胞生長因子（HGF）具有促有絲分裂、促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、抑制炎癥反應、調節(jié)免疫等多種生物學功能［10-11］。其對血管內皮細胞和上皮細胞的促有絲分裂作用和抗凋亡作用在各種血管生長因子中是最強大的［12］。在兔、小鼠缺血模型中，HGF 能刺激新生血管生成，且不論在體內還是體外試驗，HGF的血管生成活性被證實比血管內皮生長因子（VEGF）及堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）更為強大［13-14］。HGF 過度表達能刺激血管新生和側支血管形成［15］。本研究用免疫組織化學法檢測缺血心肌MVC 和MVD 及缺血心肌HGF 蛋白表達，實驗結果表明，MVC、MVD 與HGF 蛋白表達呈正相關，說明益氣活血方治療缺血性心臟病其機制可能與其促進HGF 表達相關。

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