有氧運動和G－CSF干預(yù)對心梗大鼠心肌細胞再生的影響及其機制探討

蔡夢昕，張娟娟，史秀超，田振軍

Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China.

心肌梗死（Myocardial Infarction，MI）是導(dǎo)致人類死亡的主要心血管疾病之一。MI可導(dǎo)致梗死區(qū)發(fā)生替代性纖維化，形成瘢痕組織，引起惡性心室重塑，心功能紊亂［35，42］。促進MI后心肌細胞的再生，對于改善心肌結(jié)構(gòu)重塑，提升心功能意義重大。傳統(tǒng)觀點認為，心肌細胞屬于終末分化細胞，損傷后不能再生。近年來發(fā)現(xiàn)，心肌細胞存在再生能力，正常生理和病理情況下成體心肌細胞均存組在組增組殖組現(xiàn)組象［8，9，41］，其組緩組慢組更組新組隨組年組齡組增組長組而組下組降［9］。Kajstura等發(fā)現(xiàn)，每100萬個心肌細胞中有14個處于有絲分裂期，而缺血性心肌中處于有絲分裂期的數(shù)量增加了近10倍［21］。Beltrami等同樣發(fā)現(xiàn)，MI區(qū)周圍組織存在新生的心肌細胞，但數(shù)目有限，不能滿足心肌修復(fù)的需要［8］。隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)證實內(nèi)源性心臟干／祖細胞（endogenous Cardiac Stem Cells，eCSCs）、骨髓來源的干細胞等成體干細胞，可誘導(dǎo)分化為心肌細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞，為組心組肌組修組復(fù)組提組供組了組細組胞組來組源［7，33，46，48］。目組前組針組對MI后心肌修復(fù)的研究主要包括心肌細胞周期的重新啟動、移植心肌細胞或干細胞遷移至損傷部位并刺激分化為心肌細胞，以及動員內(nèi)源性成體干細胞的歸巢、增殖和分化。由于心肌細胞本身再生能力有限，而移植的細胞又存在成瘤性和排異性等風(fēng)險，尋求安全有效的促進心肌細胞重新進入細胞周期，以及動員內(nèi)源性成體干細胞的方法和途徑具有重大意義。

研究表明，MI后給予粒細胞集落刺激因子（Granulocyte－Colony Stimulating Factor，G－CSF）可改善心功能和左心室重塑，縮小梗死面積［30，34］。G－CSF 是骨髓中多種干細胞強有力的動員劑，可增加外周血中干細胞的數(shù)量并移到受損部位，誘導(dǎo)心肌再生［16，32］。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓干細胞的歸巢與基質(zhì)細胞衍生因子－1（Stromal Cell－derived Factor，SDF－1）及其受體CXCR4 信號密切相關(guān)，并通過激活GATA－4和Nkx2.5 等轉(zhuǎn)錄因子的表達啟動心肌化的發(fā)生［4，40］。近期研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動誘導(dǎo)心臟生理性肥大的同時，伴隨有組心組肌組細組胞組增組殖組的組發(fā)組生［2，11，49］。有組氧組運組動組可組顯著提高心肌中生長因子的表達，促進c－kit＋eCSCs激活和分化，進而促進心肌再生［49］。近年來發(fā)現(xiàn)，運動同樣能夠有效提升MI患者心功能［13，17］，適度有氧運動可抑制心肌細胞凋亡［15］，縮小梗死面積，減輕膠原過度沉積和纖維化現(xiàn)象，減緩梗死后的心室重塑，改善左心室功能［52］。有研究提出，運動可激活干細胞活性，參與心血管和骨骼肌的再生過程［47］。然而運動提升MI心臟功能是否與心肌細胞再生有關(guān)，目前尚無文獻報道。因此推測，有氧運動促進心肌損傷的修復(fù)可能與干細胞動員激活有關(guān)。運動和G－CSF干預(yù)能否更有效地動員骨髓干細胞歸巢，修復(fù)心肌損傷，提升心功能需要實驗證實。本研究通過建立大鼠MI模型，檢測有氧運動和G－CSF干預(yù)對大鼠心功能、心肌組織結(jié)構(gòu)、心肌細胞增殖標記蛋白、干細胞趨化相關(guān)因子和干細胞表面抗原蛋白的表達，探討其可能機制，為MI患者的臨床康復(fù)手段與方法的篩選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

3月齡雄性Sprague－Dawley大鼠85只（購于西安交通大學(xué)實驗動物管理中心，動物質(zhì)量合格證號：陜醫(yī)動證字08－004），體重180～220g，分籠飼養(yǎng)，每籠6只，國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食。動物室內(nèi)溫度20℃～29℃，相對濕度40%～50%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進行左冠狀動脈前降支（LAD）結(jié)扎手術(shù)，術(shù)后存活75只大鼠隨機分為5組：假手術(shù)組（Sham組）、心梗組（MI組）、心梗＋運動組（ME組）、心梗＋動員劑組（MG組）和心梗＋動員劑＋運動組（MGE組）。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器：ALC－V8組動組物組呼吸機、PowerLab／8s生組理組信號采集處理系統(tǒng)、LEICA－RM2126 切片機、BM－Ⅱ型病理組織包埋機、生物組織攤烤片機、BX51 奧林巴斯光學(xué)顯微鏡、尼康熒光顯微鏡、Bio－Rad電泳儀和轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像系組統(tǒng)、PCR組儀組等。

主要試組劑：Tween 20、SABC組試組劑組盒、DAB組顯組色組試組劑組盒（武漢博士德）、兔抗多克隆抗體Ki－67、CD29、CD44、SDF－1、CXCR4、MCP－1、VLA－4（北組京組博組奧組森）和c－kit（美 國Santa Cruz）、小鼠單克隆抗體PCNA（Biotrigen）和GATA－4（美國Abcam）、Trizol（加拿大Bio Basic Inc）、Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（德國Fermentas）、PCR 引物（上海生工）。

1.3 MI大鼠模型制備

5%戊巴比妥鈉溶液（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，采用呼吸機連接大鼠呼吸面罩輔助呼吸，待大鼠呼吸平穩(wěn)后，開胸暴露心臟，在左心耳和肺動脈圓錐間下緣2 mm 處結(jié)扎左冠狀動脈前降支，進針深度為0.3～0.5 mm，同時監(jiān)測心電圖和心肌顏色變化。以心電圖ST 段弓背抬高，出現(xiàn)病理性Q 波或T 波倒置為結(jié)扎成功標志，之后逐層縫合。假心梗組只開胸穿線，不結(jié)扎。

1.4 有氧運動方案和G－CSF給藥方法

ME 和MGE組術(shù)后1周進行跑臺有氧運動。第1周為適應(yīng)性運動，以10m／min起始速度運動10min后，逐漸遞增至16 m／min，運動總時間為50 min；正式運動時，以10m／min的起始速度運動5min后，以2m／min逐漸遞增至16m／min，保持該速度運動至50min，5d／周×8周［52］。MG 和MGE組手術(shù)3h后，給予生理鹽水稀釋的重組人粒細胞集落刺激因子（rhG－CSF）皮下注射，劑量為10μg／kg／d×5d，其余3組大鼠經(jīng)皮下注射等量生理鹽水［1］。

1.5 心功能測定

采用血流動力學(xué)方法測定大鼠心功能。8周運動結(jié)束后次日，麻醉并稱重，經(jīng)右頸總動脈逆行插管至左心室，以多導(dǎo)生理記錄儀測試左室收縮壓（Left Ventricular Systolic Pressure，LVSP）、左室舒張末壓（Left Ventricular End－Diastolic Pressure，LVEDP）、左室壓力最大 上升速 率（＋dp／dtmax）和最大下降速率（－dp／dtmax）。

1.6 TTC 染色與樣本處理

麻醉后開胸摘取心臟。每組隨機取3只進行TTC 染色：生理鹽水沖洗后置于液氮中速凍，10 min后取出，切成1～2mm 薄片，1%2，3，5－氯化三苯四氮唑溶液（TTC）室溫孵育30min。數(shù)碼相機拍照，統(tǒng)計梗死區(qū)（灰白色）與非梗死區(qū)（紅色）面積。

將進行心肌組織Masson染色和免疫組織化學(xué)實驗的標本置于10%中性甲醛溶液固定24h后，常規(guī)石蠟包埋，5μm 連續(xù)切片。將用于Western Blot和RT－PCR 實驗的標本入液氮24h后，移至－80℃低溫冰存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 免疫組織化學(xué)實驗

實驗嚴格按照SABC 免疫組化染色試劑盒說明書進行。切片脫蠟至水，PBS清洗，3% H2O2浸泡10min，微波抗原修復(fù)，PBS清洗后滴加正常山羊血清封閉液（37℃，30組min），孵組育組一組抗（4℃過組夜），其組中PCNA、Ki－67、CD29 和CD44 稀釋比例為1∶80，c－kit為1∶100，PBS清洗，孵育二抗（37℃，30 min），PBS組清 洗，孵育SABC組復(fù)合組物（37℃，30min），PBS清洗，DAB顯色，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染、封片、鏡檢。設(shè)置空白對照（PBS 取代一抗和二抗）和陰性對照（PBS取代一抗）。

1.8 Western Blot實驗

8%～12% Tris－甘氨酸SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉后孵育干細胞表面抗原c－kit、CD29 和CD44（濃度分別為1∶500、1∶200 和1∶200），干細胞趨化相關(guān)蛋白SDF－1、CXCR4、VLA－4和MCP－1（濃度分別為1∶200、1∶300、1∶500 和1∶500），細胞轉(zhuǎn)錄因子GATA－4蛋白（濃度為1∶2 000），4℃過夜，孵育二抗（室溫，30min），洗膜后ECL 發(fā)光，內(nèi)參照為GAPDH。

1.9 RT－PCR 實 驗

Trizol試劑提取梗死周邊區(qū)心肌組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 反應(yīng)試劑盒說明書操作步驟，獲得cDNA 產(chǎn) 物，并組進組行PCR組反組應(yīng)，GAPDH組為組內(nèi)組部組參組照。

GATA－4（337bp）上組游組引組物：5’－AAGACGCCAGCAGGTCCTGCTGGT－3’，下組游組引組物：5’－CGCGGTGATTATGTCCCCATGACT－3’；

教師不但要在教學(xué)實踐中對學(xué)生學(xué)習(xí)情況進行監(jiān)管和引導(dǎo)，同時在發(fā)布各個任務(wù)之前，應(yīng)該設(shè)定對應(yīng)任務(wù)規(guī)劃目標。在任務(wù)設(shè)計完成以后，需要開展項目分析及課程結(jié)構(gòu)分析等工作。探究教學(xué)提綱以及課程框架，獲取各個知識模板教學(xué)框架。同時，將各個項目任務(wù)劃分為多個模塊，同時各個模塊均要結(jié)合對應(yīng)知識點將其劃分成多個部分教學(xué)內(nèi)容。教師可以根據(jù)教學(xué)要求和內(nèi)容實現(xiàn)對應(yīng)教學(xué)任務(wù)的設(shè)計，將各個學(xué)習(xí)知識隱藏在各個任務(wù)中，讓學(xué)生在落實各個任務(wù)時實現(xiàn)知識點的科學(xué)應(yīng)用，提升學(xué)習(xí)能力[4]。此外，結(jié)合項目開發(fā)模板及各個學(xué)生學(xué)習(xí)特性進行小組分配，同時下發(fā)對應(yīng)的學(xué)習(xí)任務(wù)，給實施環(huán)節(jié)做好準備。

GAPDH（595bp）上組游組引組物：5’－CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT－3’，下組游組引組物：5’－AGGGGCCATCCACAGTCTTC－3’。

擴增條件：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共循環(huán)35次。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，100V 電壓電泳25min，凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.10 圖像、數(shù)據(jù)采集與分析

顯微鏡圖像經(jīng)Image－Pro Plus 5.1 軟件采集并分析；Western Blot膠片采用Image Quant TL 軟件進行分析，所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0Demo軟件轉(zhuǎn)換作圖。所有數(shù)據(jù)均組采組用SPSS組17.0組軟組件組包組進組行組處組理，采組用One－Way組ANOVA組進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果均以）表示，組間顯著性差異水平為P＜0.05和P＜0.01。

2 實驗結(jié)果

2.1 MI模型大鼠存活率和心功能測定結(jié)果

MI術(shù)后75只大鼠，經(jīng)8周實驗干預(yù)后，存活為100%。心功能測試結(jié)果表明，8周后，與Sham組比較，MI組LVEDP顯著升高（P＜0.01），LVSP 和±dp／dtmax顯著降低（P＜0.01）；與MI組 比 較，ME、MG 和MGE組LVEDP顯著下降（P＜0.01），LVSP顯著升高（P＜0.01），±dp／dtmax顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與ME 和MG組比較，MGE組LVEDP下降更為顯著（P＜0.05，圖1）。提示，MI嚴重損害了心功能，有氧運動或G－CSF可有效改善心功能，且聯(lián)合干預(yù)效果優(yōu)于單一因素。

2.2 TTC 染色結(jié)果

TTC染色后，紅色為正常心肌組織，白色為壞死心肌組織。梗死面積百分比＝梗死面積／總面積×100%。與對照組比較，MI組梗死區(qū)明顯，梗死面積百分比為27.33±4.62%；與MI組比較，ME、MG 和MGE組梗死面積明顯縮小，梗死面積百分比分別為18.07±2.41%（P＜0.05）、16.68±5.20%（P＜0.05）和9.23±2.61%（P＜0.01），且聯(lián)合干預(yù)組梗死面積明顯小于單純干預(yù)組（P＜0.05）（圖2）。

圖1 本研究大鼠心功能測試結(jié)果示意圖Figure 1.Changes of Different Index of Hemodynamic in Rats

圖2 本研究大鼠梗死面積變化示意圖Figure 2.Changes of Infarct Size in Rats

2.3 Masson染色結(jié)果

Masson染色結(jié)果顯示，膠原纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色、細胞核呈藍紫色。正常心肌組織膠原纖維染色清晰，區(qū)分明顯，細胞排列整齊，膠原纖維分布正常；MI組可見典型的替代性纖維化，膠原纖維過度增生，并向梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)延伸；ME、MG 和MGE組梗死區(qū)膠原纖維較MI組減少，纖維化程度降低，且MGE組效果更為明顯（圖3A）。

圖3 本研究心臟組織Masson染色、Ki－67和PCNA蛋白表達的免疫組化結(jié)果示意圖Figure 3.Masson Staining and Immunohistochemical Results of Ki－67and PCNA in Rat Myocardium

2.4 有氧運動和／或G－CSF干預(yù)對心肌細胞增殖的影響

免疫組化結(jié)果顯示，正常心肌組織PCNA 和Ki－67陽性顆粒主要分布于心肌細胞核，表達很少；與Sham組比較，MI組梗死區(qū)及其邊緣，可見少量PCNA 和Ki－67蛋白表達；與MI組比較，ME、MG 和MGE組表達顯著升高（P＜0.01）；且與ME和MG組相比，MGE組表達顯著升高（P＜0.05），（圖3B～D）。提示，MI后的損傷微環(huán)境可誘導(dǎo)細胞增殖，有氧運動或G－CSF干預(yù)可顯著誘導(dǎo)心肌細胞周期的啟動，促進心肌細胞增殖，且二者雙重干預(yù)效果更為顯著。

2.5 有氧運動和／或G－CSF 干預(yù)對心肌組織干細胞表面抗原表達的影響

2.6 有氧運動和／或G－CSF干預(yù)對心肌組織干細胞趨化相關(guān)蛋白表達的影響

Western Blot結(jié)果顯示，與對照組比較，MI組VLA－4蛋白表達顯著增加（P＜0.01），SDF－1、CXCR4 和MCP－1蛋白表達無顯著性差異；與MI組比較，ME、MG 和MGE組VLA－4和CXCR4蛋白表達增加（P＜0.05，P＜0.01），SDF－1和MCP－1無顯著性差異，MGE組CXCR4表達顯著高于ME組（P＜0.05，圖5）。

2.7 有氧運動和／或G－CSF 干預(yù)對心肌組織轉(zhuǎn)錄因子GATA 4表達的影響

與對照組比較，MI組GATA－4 mRNA 和蛋白表達顯著下降（P＜0.01，P＜0.05）；與MI組比較，ME 和MG組GATA－4 mRNA 和蛋白均有所上調(diào)，但無顯著差異；MGE組GATA－4mRNA 和蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01），且與單純干預(yù)組比較，均顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，圖6）。

3 分析與討論

3.1 有氧運動和／或G－CSF 干預(yù)可改善MI大鼠心功能和心肌組織結(jié)構(gòu)

MI早期，梗死區(qū)和非梗死區(qū)心肌細胞代償性肥大，心肌組織出現(xiàn)良性重塑現(xiàn)象，穩(wěn)定心功能。隨著病理進程的發(fā)展，心肌細胞大量丟失，成纖維細胞異常增生，膠原合成增加，尤其是Ⅰ型膠原大量沉積，心臟惡性重塑嚴重，最終可導(dǎo)致代謝失常及充血性心力衰竭。MI后改善心肌組織的惡性重塑和提升心功能是臨床治療的關(guān)鍵。眾所周知，適宜的運動鍛煉能夠改善正常生理情況下的心臟功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)。近年來，運動訓(xùn)練已被認為是一種重要的心血管疾病預(yù)防組和組康組復(fù)組的組手組段［6，39，45］。實組驗組證組實，適組宜組的組運組動訓(xùn)練可有效提升MI后的心功能［24］。運動訓(xùn)練可改善左心室重塑現(xiàn)象，且MI后訓(xùn)練開始時間越早（MI后第1周），改善效果越顯著［20］。

圖5 本研究大鼠心臟組織SDF－1、CXCR4、VLA－4和MCP－1蛋白表達結(jié)果示意圖Figure 5.Results of Protein Expression of SDF－1，CXCR4，VLA－4and MCP－1in Rat Myocardium

圖6 本研究大鼠心肌組織中GATA4蛋白和mRNA表達結(jié)果示意圖Figure 6.Results of Protein and mRNA Expression of GATA4in Rat Myocardium

隨著干細胞理論與技術(shù)的發(fā)展，已為MI后的細胞治療開辟了新的途徑。有文獻報道，G－CSF 單獨使用或聯(lián)合SCF使用均可顯著提高MI后的心功能［23］。本研究實驗結(jié)果證實，MI后1周進行有氧訓(xùn)練和G－CSF干預(yù)，大鼠心肌梗死面積減小，心臟惡性重塑得到改善，LVSP 和±dp／dtmax顯著升高，LVEDP 降低，表明MI早期進行有氧訓(xùn)練和G－CSF干預(yù)，顯著提升心功能，且發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合干預(yù)效果優(yōu)于單一因素。

3.2 有氧運動和／或G－CSF 干預(yù)可促進MI心臟的心肌細胞增殖

MI后心肌重塑過程復(fù)雜，心肌實質(zhì)和間質(zhì)成分比例改變，可直接影響心功能的穩(wěn)定。雖然臨床認為，MI后瘢痕組織的薄厚與心臟室壁瘤的發(fā)生率高度相關(guān)，但過度的瘢痕組織會導(dǎo)致心室順應(yīng)性降低，嚴重影響心臟的舒縮能力，而心肌實質(zhì)成分中的功能性心肌細胞數(shù)目增加，對于心肌組織結(jié)構(gòu)完整和心功能提升意義重大。

傳統(tǒng)觀點認為，心肌細胞在胚胎期和新生期具有增殖能力［36］，成體后心肌細胞即退出細胞周期。晚近研究表明，成組年組哺組乳組動組物組心組臟組具組有組再組生組能組力［7，9，22］，但組再組生組能組力組非常有限，不能滿足大面積心肌損傷后的修復(fù)。目前，關(guān)于心肌細胞再生的來源問題及其激活因素與機制的研究備受關(guān)注。Bostrom 和Waring等研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動可引起心肌細胞的生理性肥大，同時可促進心肌細胞PCNA 和Ki－67的表達及Brdu標記的心肌細胞數(shù)目的增多，促進心肌細胞的有絲分裂［11，49］，而運動與病理性心臟心肌細胞增殖的研究，目前尚無文獻報道。本研究通過對MI心臟心肌細胞PCNA 和Ki－67 的實驗觀察與分析，發(fā)現(xiàn)MI大鼠心臟存在心肌細胞增殖現(xiàn)象，可能與心肌損傷微環(huán)境的誘導(dǎo)有關(guān)；有氧運動可顯著上調(diào)心肌組織PCNA 和Ki－67 的表達，表明有氧運動可有效促進MI心臟的心肌細胞增殖。G－CSF可有效動員干細胞歸巢于心梗部位，也可直接作用于心肌組細組胞，產(chǎn)組生組保組護組效組應(yīng)［18，19］。本組研組究組結(jié)果組發(fā)組現(xiàn)，GCSF可促進MI大鼠心臟的心肌細胞增殖，且有氧運動和G－CSF雙重干預(yù)顯著優(yōu)于單純干預(yù)的效果。

3.3 有氧運動和／或G－CSF 干預(yù)可促進干細胞歸巢與分化

目前研究認為，具有增殖潛能的心肌細胞來源主要有以下4種：一是近期報道的成體心肌細胞［38］，具有收縮功能的單核心肌細胞，可通過誘導(dǎo)心肌細胞重新進入細胞周期，促進心組肌組細組胞組增組殖［10，25，54］；二組是組心組外組膜組上組的c－kit＋細胞，心肌損傷后，可溶性細胞因子釋放進入心包液，可刺激心外膜的c－kit＋細胞分化，通過促血管再生和調(diào)節(jié)心肌組織結(jié)構(gòu)來促進心肌再生［28］；三是循環(huán)中的干細胞，骨髓衍生的干細胞等成體干細胞，可在損傷信號誘導(dǎo)下進入外周血，募集到心肌損傷部位進行分化，在一定程度上修復(fù)心肌組織［33，50］；四是eCSCs，eCSCs可表達c－kit、Sca1 和IsL－1等干細胞表面標記，具有一定心肌化功能，在損傷微環(huán)境誘導(dǎo)下eCSCs 可增殖分化，直接參與心肌損傷的修復(fù)［7，26，29］。eCSCs為心肌損傷組后的修復(fù)組提組供組了直接的組細組胞來源，Urbanek等發(fā)現(xiàn)，在急性或慢性MI心臟中，CSCs數(shù)目均顯著增加［46］。Lin－c－kit＋eCSCs已被證實可參與功能性心肌再生［7］。此外，自體骨髓干細胞由于具有多能分化性、數(shù)量多、來源廣泛等特點，已成為關(guān)注的焦點。G－CSF作為有效的干細胞動員因子，可動員間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）進入外周血，募集到心肌損傷部位［16］，并通過調(diào)控心肌特異基因的表達，誘導(dǎo)干細胞向心肌細胞、血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的分化。有效激活eCSCs和骨髓干細胞趨化到損傷部位，修復(fù)心肌組織，可為心肌再生奠定了細胞學(xué)基礎(chǔ)。c－kit為經(jīng)典的干細胞標記，可表達于eCSCs等多種細胞表面［7］，CD29 和CD44 為MSCs的表面標記抗原［12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G－CSF干預(yù)可有效促進梗死邊緣區(qū)心肌組織c－kit和CD29的表達，提示G－CSF促進了c－kit＋和CD29＋干細胞歸巢到MI部位，參與心肌組織修復(fù)。Waring等發(fā)現(xiàn)，有氧運動可促進心肌組織中ckit＋eCSCs的激活和分化，進而促進正常心臟的心肌細胞再生［49］，但對MI心臟是否有效，需要實驗證實。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有氧運動促進了MI邊緣區(qū)心肌組織c－kit和CD29蛋白表達升高，且有氧運動和G－CSF 雙重干預(yù)顯著高于單純干預(yù)的效果。推測，有氧運動可促進干細胞動員歸巢到MI部位，且有氧運動和G－CSF 雙重干預(yù)可有效促進心肌中c－kit＋、CD29＋和CD44＋干細胞的增多。分析認為，增多的干細胞群可能包含兩部分，即心肌固有的干細胞和循環(huán)中骨髓干細胞等，其具體來源有待于深入研究。

研究證實，包括MSCs在內(nèi)的多種干細胞在體外誘導(dǎo)分化過程中，均可激活GATA－4 和Nkx2.5 等轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而啟動心肌化的發(fā)生［4］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有氧運動或G－CSF干預(yù)均使心肌組織GATA 4 基因和蛋白表達有上升趨勢，而二者的聯(lián)合干預(yù)使GATA 4 表達顯著性增加，說明聯(lián)合干預(yù)更有效地促進了干細胞向心肌細胞的分化。分析認為，有氧運動可顯著上調(diào)心肌組織中多種細胞因子的表達［14］，而生長因子對于心肌細胞的增殖和干細胞的分化具有促進組作用［49］；G－CSF組動組員組效果較好，二組者組聯(lián)合干預(yù)可通過促進生長因子的表達，促進了干細胞的分化，參與心肌細胞的再生。

3.4 有氧運動和／或G－CSF 干預(yù)促進干細胞歸巢的機制探討

心肌干細胞或自體其他成體干細胞修復(fù)心肌組織，其過程包括干細胞的動員、歸巢、遷移和分化，并與損傷微環(huán)境的趨化因子和細胞因子密切相關(guān)。心?？烧T導(dǎo)心臟損傷部位產(chǎn)生大量趨化因子，如白介素－8（interleukin，IL－8），SDF－1α和MCP－1 等。循環(huán)中的干細胞可被誘導(dǎo)因素如G－CSF動員進入外周血，循環(huán)至損傷部位，通過粘附分子（VLA－4等）的介導(dǎo)粘附于內(nèi)皮細胞，由趨化因子介導(dǎo)穿過內(nèi)皮細胞遷徙到組織中，進入損傷組織中定居、分化和增殖［40］，其中，SDF－1／CXCR4組信組號組軸組的組發(fā)組現(xiàn)，揭組示組了組干組細胞趨化歸巢的重要機制［27］。有實驗表明，大鼠MI區(qū)周圍通過移植轉(zhuǎn)染了SDF－1 基因的成體心肌細胞，同時給予G－CSF可誘導(dǎo)CD117＋干細胞歸巢到梗死區(qū)，而未表達SDF－1的移植細胞及G－CSF干預(yù)，其細胞歸巢效果均無統(tǒng)計學(xué)組意組義［5］。Abbott等組研組究組發(fā)組現(xiàn)，SDF－1／CXCR4組信組號組軸的阻斷，可顯著減少骨髓干細胞移植后進入MI區(qū)的數(shù)目［3］，充分組說組明組了SDF－1／CXCR4組信號組軸組在組干細胞歸組巢組中的作用。本研究實驗顯示，MI大鼠VLA－4 蛋白表達增加，SDF－1、CXCR4和MCP－1均無顯著性差異，而有氧運動或G－CSF干預(yù)均使大鼠心肌組織VLA－4 和CXCR4 蛋白表達顯著增加，SDF－1 和MCP－1組無組顯組著組性組差組異，且組二組者組聯(lián)合干預(yù)組使CXCR4組表組達組高組于組單組純組運組動組干組預(yù)。SDF－1組和MCP－1在MI發(fā)生的早期表達增高，后期在運動過程中會產(chǎn)生適應(yīng)現(xiàn)象，導(dǎo)致SDF－1 和MCP－1 差異不顯著。目前關(guān)于有氧運動與CXCR4表達的關(guān)系未見報道。M－CSF 或G－CSF動員劑干預(yù)均可動員CXCR4＋細胞通過SDF－1／CXCR4信號軸歸巢于心梗部位，使心梗死面積縮小，改善MI后左心室的病理性重塑［31］。本研究實驗發(fā)現(xiàn)，有氧運動和G－CSF雙重干預(yù)可使大鼠心肌CXCR4 表達顯著增加，提示二者有效動員了CXCR4＋細胞，通過VLA－4 等粘附因子遷移到心肌損傷部位，促進了梗死大鼠心肌中的干細胞數(shù)目。

MI后心功能的提升由多種因素決定，包括保護現(xiàn)存的心肌細胞，降低纖維化程度和心肌細胞丟失水平，促進心肌細胞和血管再生，改善氧化應(yīng)激和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控等。細胞周期調(diào)控因子、促血管生成素－1（Angiopoietin－1）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、胰組島組素組樣組生組長組因組子－1（Insulin－like Growth Factor，IGF－1）和組肝組細組胞組生組長組因組子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）等均對心梗心臟的心肌細胞數(shù)目增多具有積極作用［37，43，44，51］，并且發(fā)現(xiàn)Periostin、Neuregulin1／ErbB4以及C／EBPβ在心肌細胞增殖過程中發(fā)揮正性或負性調(diào)節(jié)作用［10，11，25］。運動作為一種組整組體組刺組激組效組應(yīng)，可組對組機組體組產(chǎn)組生組系統(tǒng)性影響。動物實驗表明，運動可通過抑制心肌細胞凋亡［15］、減輕纖維化程度［52］、降低氧化應(yīng)激［53］等組方組面組有組效組提高MI后的心功能。但關(guān)于有氧運動促進MI后心肌細胞再生至今尚無文獻報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)有氧運動和GCSF可通過SDF－1／CXCR4軸，有效促進MI后成體干細胞的動員、歸巢和分化，促進心肌細胞增殖，提升心功能，但上述促生長因子和信號通路在運動促進心肌再生中的作用仍需深入研究。

4 結(jié)論

有氧運動和／或G－CSF干預(yù)均可減輕心梗心臟的替代性纖維化，有效提升大鼠心功能；發(fā)現(xiàn)有氧運動和G－CSF可通過SDF－1／CXCR4軸，有效促進MI后成體干細胞的動員、歸巢和分化，促進心肌細胞增殖，有效提升心功能，且二者聯(lián)合干預(yù)效果更為顯著。

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