微弧氧化鈦表面對成骨細胞形態(tài)及細胞骨架的影響

喬磊???丁仲鵑???張立亞???牛濤

[摘要] 目的 研究微弧氧化鈦表面對成骨細胞形態(tài)及細胞骨架的影響。方法 將直徑15 mm、厚度1 mm的純鈦片根據(jù)表面處理方法不同分為4組：機械打磨（G）組、噴砂（SB）組、打磨微弧氧化（GMAO）組和噴砂微弧氧化（SBMAO）組。采用掃描電子顯微鏡（SEM）、激光共聚焦顯微鏡（LSCM）研究鈦片表面成骨細胞生長情況及細胞骨架的改變。結果 成骨細胞接種12 h后，各組細胞均沿鈦片表面鋪展開，且GMAO組和SBMAO組細胞覆蓋于火山口狀微孔上。各組肌動蛋白纖維清晰可見，GMAO組和SBMAO組肌動蛋白纖維平行排列，匯聚成束伸向微孔內。結論 微弧氧化后的鈦表面可以影響成骨細胞鋪展的形態(tài)及細胞骨架的排列。

[關鍵詞] 微弧氧化； 激光共聚焦顯微鏡； 成骨細胞； 細胞骨架

[中圖分類號] R 783.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.006

種植體成功的關鍵在于形成良好的骨結合，而成骨細胞是骨結合的關鍵。種植體植入后，成骨細胞首先在種植體表面黏附、叢集，然后分泌骨基質，啟動新骨生成。新骨從種植體表面逐漸向骨創(chuàng)面生長、延伸，最終形成種植體與骨組織的骨結合。由此可見，提高成骨細胞的成骨活性是提高種植成功率的有效途徑。目前種植體表面改性的主要方法有表面形貌改性、表面化學成分改性及表面功能涂層改性。微弧氧化是目前研究中的熱點。有研究[1-3]報道，微弧氧化表面對成骨細胞的黏附、增殖、分化均有促進作用。本實驗在打磨和噴砂基礎上，采用微弧氧化法處理鈦片，研究微弧氧化鈦表面對成骨細胞形態(tài)及細胞骨架（cytoskeleton，CSK）的影響。

1 材料和方法

1.1 鈦片的表面處理和分組

將直徑為15 mm、厚度為1 mm的鈦片，按處理方法不同分為4組：機械打磨（G）組、噴砂（SB）組、打磨微弧氧化（GMAO）組和噴砂微弧氧化（SBMAO）組。

G組采用機械打磨方法，依次用防水砂紙240、360、600、800目同向打磨鈦片，使表面光滑，呈金屬光澤，肉眼觀劃痕一致。SB組在機械打磨的基礎上，使用40～60目的二氧化鈦砂在6.5 kPa、10 cm距離條件下均勻噴砂。GMAO組為將經過機械打磨的鈦片用丙酮在超聲波清洗機中清洗，干燥后進行微弧氧化。微弧氧化電解液的基本組成成分為20 g·L-1 Ca（CH3COO）2·H2O、9.3 g·L-1 Na5P3O10和Na2SiO3·9H2O，去離子水為溶劑，試劑均為分析純。將鈦片作為陽極，不銹鋼電解槽為陰極進行微弧氧化。實驗所用的電參數(shù)為：正向電壓350 V，負向電壓160 V，頻率800 Hz，處理時間20 min，電解液通過冷卻水循環(huán)系統(tǒng)進行冷卻，微弧氧化過程中溫度控制為15～

30 ℃。SBMAO組為將經過40～60目噴砂的鈦片用丙酮在超聲波清洗機中清洗，干燥后進行微弧氧化。

1.2 成骨細胞的體外培養(yǎng)

采用改進后的貼壁組織塊分步消化法體外培養(yǎng)成骨細胞。

1.3 鈦片表面成骨細胞的形態(tài)變化

取生長至第3代的成骨細胞，無菌PBS沖洗后0.25%胰酶消化，吹打均勻后調整細胞密度至每毫升4×104個，用加樣器吸取500 ?L細胞懸液接種于放有預置清潔鈦片的24孔板內，每組3枚鈦片。當分別培養(yǎng)至2、4、12 h后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，室溫加入4%多聚甲醛固定10 min，乙醇梯度脫水（體積分數(shù)分別為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，前6種體積分數(shù)每種脫水2次，每次3 min，100%體積分數(shù)脫水3次，每次3 min），真空干燥，噴金，掃描電子顯微鏡（scanning electron micro-scope，SEM）觀察成骨細胞形態(tài)并拍照。

1.4 鈦片表面成骨細胞內CSK的變化

將接種好成骨細胞的各組鈦片進行異硫氰酸熒光素-鬼筆環(huán)肽（fluorescein isothiocyanate-phalloidin，F(xiàn)ITC-phalloidin）室溫染色60 min，PBS清洗細胞3次，置于激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）下觀察CSK的微絲形態(tài)變化并拍照。

2 結果

2.1 鈦片表面成骨細胞形態(tài)的變化

成骨細胞接種于鈦片表面不同時間的細胞形態(tài)見圖1。

成骨細胞接種2 h（圖1第1行），與剛消化下來時的圓形細胞相比，各組細胞已經有明顯的伸展，體積也有增大。G組細胞向四周伸展，無方向性，細胞邊緣與鈦表面結合緊密。SB組細胞有選擇性地附于噴砂形成的孔洞內，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞足進一步伸展攀附于孔洞邊緣，與鈦片粗糙表面結合緊密。GMAO組細胞完全平鋪于基底上，周圍細胞足伸入火山狀孔洞內。SBMAO組細胞完全鋪展開，大部分細胞位于凹陷處，形態(tài)不規(guī)則，細胞覆蓋于大量火山狀孔洞上，細胞扁平，甚至可以見到整個細胞覆蓋于孔洞之上，周邊細胞足伸入孔洞內，與孔洞結合緊密。

成骨細胞接種于鈦片表面4 h（圖1第2行），各組細胞的體積進一步增大。G組細胞形狀扁平，細胞長軸方向與表面劃痕方向一致。SB組細胞體積已經大于表面孔洞，細胞跨越孔洞凹陷，周邊細胞足明顯伸入周圍的細小孔洞內。SBMAO組細胞與SB組一樣跨越孔洞凹陷，周邊細胞足已經完全伸入上下聯(lián)通的孔洞內。GMAO組細胞較SBMAO組更為扁平。

成骨細胞接種于鈦片表面12 h（圖1第3行），各組細胞鋪展面積進一步增大。G組細胞沿著表面劃痕方向完全鋪展開。SB組細胞完全跨越表面孔洞凹陷，位于凹陷上方，周邊細胞足伸長更加明顯。GMAO和SBMAO組細胞之間有偽足相連，細胞有連接成片的趨勢，周圍可見伸入孔洞內的三維網(wǎng)絡狀結構。

2.2 鈦表面對成骨細胞內CSK的影響

成骨細胞接種于鈦片表面不同時間的細胞內CSK的微絲形態(tài)見圖2。成骨細胞接種2 h（圖2第1行），G 組肌動蛋白纖維成束狀，有沿打磨形成的劃痕方向鋪展的趨勢；SB組細胞陷于噴砂形成的孔洞中，肌動蛋白纖維束沿孔洞的邊緣鋪展，形態(tài)不規(guī)則；GMAO和SBMAO組肌動蛋白纖維沿小孔邊緣伸展，微絲結構密集且不清晰，兩組的差異不明顯。

成骨細胞接種4 h（圖2第2行），G組成骨細胞肌動蛋白纖維沿劃痕方向生長，纖維伸長。SB組肌動蛋白纖維沿著表面形態(tài)排列，將細小的孔洞覆蓋，有的伸入孔洞內。GMAO和SBMAO組表面的細胞均鋪展開生長，將火山口狀結構覆蓋，火山口處肌動蛋白纖維沿火山口形成圈；GMAO組較SBMAO組細胞的形態(tài)更規(guī)則，類似于G組，而SBMAO組細胞形態(tài)更近似于SB組。

成骨細胞接種12 h（圖2第3行），各組細胞體積均增大，肌動蛋白纖維均清晰可見，纖維束平行排列與細胞長軸一致。G組肌動蛋白纖維束沿劃痕方向排列。SB組細胞向四周鋪展，肌動蛋白纖維沿孔洞邊緣排列，細胞覆蓋在孔洞上方。GMAO和SBMAO組細胞肌動蛋白纖維平行排列，圈形排列的肌動蛋白纖維減少，肌動蛋白纖維在細胞邊緣處匯聚成束，伸向孔洞內。

3 討論

本實驗采用LSCM觀察不同鈦片表面對成骨細胞CSK的影響。傳統(tǒng)熒光顯微鏡是采用很寬的照明光束照射樣品進行觀察，因此存在樣品在焦平面時的結構能清晰成像，但是在非焦平面的結構成像模糊的問題。LSCM采用點照明和點探測，利用照明針孔與探測針孔的共軛原理，可以得到連續(xù)的光切圖像，呈現(xiàn)樣品真實清晰的三維結構[2]。

本文所用抗體FITC-phalloidin能特異性地與聚合態(tài)的肌動蛋白結合。肌動蛋白是微絲的主要成分，參與維持細胞正常形態(tài)和結構，以及力學信號傳導等多種功能，其結構重排及聚合和解聚的動態(tài)變化在一定程度上反映了細胞的功能狀況。本研究中，成骨細胞接種于鈦片表面2 h后各組細胞肌動蛋白纖維聚集，分布于表面隆起處；接種4 h后，2個微弧氧化組表面火山口處細胞肌動蛋白纖維均沿火山口形成圈，這可能與成骨細胞分泌的纖連蛋白多集中于表面粗糙孔洞的邊緣處有關[3]。

整合素分子能特異性地與細胞外基質（extra-cellular matrix，ECM）中的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列結合，將細胞外的ECM分子與細胞內的骨架蛋白連接起來，形成ECM-整合素-CSK黏著斑，傳導細胞內外的雙向信號[4]。整合素與ECM結合后就與CSK發(fā)生聯(lián)系，并發(fā)生簇集，從而介導細胞的黏附和遷移。材料表面經處理后，其粗糙度增加，細胞與材料的接觸面積增大，這樣在植入體內后，ECM會在材料表面形成一層生物大分子層，與細胞表面的整合素結合[5]。本實驗中，經過微弧氧化處理的鈦片表面的粗糙度明顯高于G組及SB組。當成骨細胞黏附于材料表面后，開始鋪展并伴隨著偽足形成。ECM-整合素-CSK黏著斑在信號傳導過程中重組肌動蛋白骨架，細胞變平并鋪展[6]。本實驗結果顯示，12 h后各組細胞均已完全鋪展，細胞肌動蛋白纖維排列成束且有規(guī)律，GMAO與SBMAO組均可見細胞之間的肌動蛋白纖維束相互連接，這與SEM觀察到的細胞有連接成片的趨勢相一致，提示SBMAO組與GMAO組鈦片表面均有利于成骨細胞的ECM與整合素結合，從而介導細胞的黏附和遷移。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細胞之間的肌動蛋白纖維鋪展的差異逐漸減小，到培養(yǎng)12 h時，肌動蛋白纖維的鋪展無明顯差異，只是2個微弧氧化組細胞有連接成片的趨勢。

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（本文編輯 吳愛華）