含精氨酸的抗敏拋光膏對(duì)暴露牙本質(zhì)表面變異鏈球菌黏附的影響

劉音辰　付東杰　黃翠　裴丹丹　孫華嶺

[摘要] 目的 研究含精氨酸抗敏拋光膏對(duì)暴露牙本質(zhì)表面變異鏈球菌黏附的影響。方法 暴露牙本質(zhì)小管，使用浮石粉和抗敏拋光膏處理表面，觀察其粗糙度的變化。體外培養(yǎng)變異鏈球菌，觀察其在牙本質(zhì)片表面黏附及葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTFs）基因表達(dá)情況。結(jié)果 使用浮石粉及抗敏拋光膏均能有效降低表面粗糙度，抗敏拋光膏處理后的牙本質(zhì)能明顯抑制gtfB和gtfC基因的表達(dá)。結(jié)論 含精氨酸抗敏拋光膏能抑制變異鏈球菌黏附及gtfB和gtfC基因的表達(dá)，對(duì)敏感牙本質(zhì)區(qū)域齲病發(fā)生具有一定防治作用。

[關(guān)鍵詞] 精氨酸； 拋光膏； 黏附

[中圖分類號(hào)] R 781.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.003

牙本質(zhì)敏感是成年人常見(jiàn)的口腔疾病之一，主要表現(xiàn)為牙本質(zhì)暴露引起的短而尖銳的疼痛[1]。暴露的牙本質(zhì)易受到口腔環(huán)境中細(xì)菌及其毒素的侵襲，引起齲病、牙周病、牙髓炎等口腔疾病[2]?？谇患?xì)菌的黏附對(duì)于菌斑生物膜的形成至關(guān)重要，其黏附能力與致病性密切相關(guān)?？谇唤M織表面粗糙度、周圍環(huán)境是影響細(xì)菌黏附的重要因素[3]。

目前市場(chǎng)上有一種含有8%精氨酸的抗敏拋光膏，可以有效封閉暴露的牙本質(zhì)小管，具備較好的臨床脫敏效果[4-5]?？谇绘溓蚓芡ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)氨基作用代謝精氨酸產(chǎn)生氨，改變周圍環(huán)境pH值。因此，使用含精氨酸的抗敏拋光膏可能對(duì)變異鏈球菌在暴露牙本質(zhì)表面的黏附產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)選取變異鏈球菌這一主要致齲菌，來(lái)研究含精氨酸的抗敏拋光膏對(duì)暴露牙本質(zhì)表面變異鏈球菌黏附的影響，進(jìn)而探討敏感牙暴露區(qū)域齲病防治的新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

含精氨酸抗敏拋光膏（美國(guó)高露潔公司），800、1 200、1 500、1 800、2 000、3 000目水砂紙（武漢玉立砂帶集團(tuán)股份有限公司），牛心腦浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基（DB公司，美國(guó)），熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（大連寶生物工程有限公司），掃描電子顯微鏡（scanning electronic micros-cope，SEM）（Quanta 200，F(xiàn)EI公司，荷蘭），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國(guó)）。

1.2 樣本的制備和粗糙度分析

1.2.1 暴露牙本質(zhì)樣本的制備 收集18～25歲患者因正畸或阻生原因拔除的新鮮無(wú)齲第三磨牙，使用精密慢速切割鋸沿牙冠長(zhǎng)軸垂直方向切取牙冠中部的牙本質(zhì)，每顆離體牙選取一個(gè)樣本，加工成5 mm×

5 mm×1 mm的牙本質(zhì)片，共27個(gè)樣本。流水下逐級(jí)打磨拋光牙本質(zhì)片，超聲波清洗后，所有的樣本在1%的檸檬酸中處理20 s，去除玷污層和開(kāi)放牙本質(zhì)小管，蒸餾水沖洗干凈。由于表面處理不同，將樣本分為3組，具體如下。1）抗敏拋光膏組：在牙本質(zhì)片表面涂上充足的抗敏拋光膏，用橡皮杯低速拋光2次，每次30 s；2）浮石粉組：在牙本質(zhì)片表面涂布足量直徑為2 μm的浮石粉糊劑，用橡皮杯相同力度低速拋光2次，每次30 s；3）對(duì)照組：樣本表面不做任何處理。所有樣本均用蒸餾水沖洗干凈，37 ℃蒸餾水中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 牙本質(zhì)表面粗糙度的測(cè)量 每組各隨機(jī)選取3個(gè)樣本，在每個(gè)樣本表面選取2個(gè)位點(diǎn)，用光學(xué)輪廓儀測(cè)量各組樣本表面粗糙度（Ra）。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

將復(fù)蘇后的變異鏈球菌（UA159，ATCC#700610）接種于BHI中，在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)過(guò)夜。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌懸液在600 nm處的光密度（optical density，OD）值調(diào)整為0.35，然后用含1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基稀釋細(xì)菌懸液（1︰100）作為細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)工作液。

1.4 細(xì)菌在暴露牙本質(zhì)表面的黏附實(shí)驗(yàn)

將紫外照射消毒后的牙本質(zhì)片置于24孔板中，每孔加入1 mL細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)液。37 ℃有氧條件下，細(xì)菌在暴露牙本質(zhì)表面培養(yǎng)4 h后，每組各取3個(gè)樣本，用PBS緩沖液沖洗去除未黏附的細(xì)菌，然后以2.5%戊二醛室溫固定30 min，梯度脫水后噴金處理，置于SEM下觀察細(xì)菌在牙本質(zhì)片表面的黏附情況。

培養(yǎng)24 h后，每組另取3個(gè)樣本，收集牙本質(zhì)表面黏附的細(xì)菌。經(jīng)過(guò)超聲洗滌、溶菌酶去除細(xì)胞壁后，Trizol抽提、DNA酶Ⅰ消化去除基因組DNA等步驟獲得細(xì)菌總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行變異鏈球菌黏附相關(guān)基因——葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferases，GTFs）基因（gtfB、gtfC、gtfD）以及16S rRNA內(nèi)參的熒光定量PCR擴(kuò)增[6]，檢測(cè)相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。具體基因及引物序列見(jiàn)表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用單因素方差分析3組間黏附相關(guān)基因表達(dá)水平差異的顯著性，并行兩兩比較的q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙本質(zhì)表面粗糙度

通過(guò)光學(xué)輪廓儀所繪制的3D圖見(jiàn)圖1。對(duì)照組表面高低不平，其粗糙度Ra值為（0.437±0.052） μm；浮石粉組表面較對(duì)照組光滑，其Ra值減小為（0.325±0.013） μm；抗敏拋光膏組牙本質(zhì)表面最光滑，其粗糙度Ra值為（0.258±0.037）μm，明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。

2.2 變異鏈球菌在牙本質(zhì)表面黏附的形態(tài)學(xué)觀察

培養(yǎng)4 h后變異鏈球菌開(kāi)始黏附于牙本質(zhì)表面，對(duì)照組表面牙本質(zhì)小管完全暴露，許多成團(tuán)聚集的細(xì)菌黏附于小管周圍，部分甚至進(jìn)入至小管內(nèi)部（圖2）；浮石粉組牙本質(zhì)小管有不同程度的堵塞，細(xì)菌呈鏈狀分布，且數(shù)量較對(duì)照組明顯減少（圖2）；抗敏拋光膏組牙本質(zhì)幾乎完全堵塞，細(xì)菌分布更為分散，數(shù)量也最少（圖2）。

2.3 細(xì)菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因mRNA的表達(dá)情況

將各樣本及內(nèi)參得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得到變異鏈球菌黏附相關(guān)基因gtfB、gtfC、gtfD和內(nèi)參16S rRNA的定量結(jié)果，然后把gtfB、gtfC、 gtfD的定量結(jié)果用相應(yīng)樣本的16S rRNA進(jìn)行校正，再比較不同樣品間的gtfB、gtfC、gtfD表達(dá)的相對(duì)定量。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后3組樣本間變異鏈球菌gtfB和gtfC的mRNA拷貝數(shù)之間均有顯著差異（P<

0.05），而3組樣本gtfD基因間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05）（圖3）。

圖 3 3組gtfB、gtfC、gtfD基因的表達(dá)水平

Fig 3 Expression lever of gtfB， gtfC， gtfD of three groups

3 討論

牙本質(zhì)敏感區(qū)域通常存在牙本質(zhì)暴露的情況，并且存在大量口腔細(xì)菌包圍。致病菌及其代謝毒素很容易通過(guò)開(kāi)放的牙本質(zhì)進(jìn)入牙本質(zhì)甚至根管內(nèi)，進(jìn)而引起牙本質(zhì)、牙周、牙髓和根尖周的細(xì)菌感染性疾病。目前治療牙本質(zhì)敏感的方法主要集中于敏感引起的疼痛的控制，而忽略了暴露牙本質(zhì)齲病的關(guān)注。因此，有效防治暴露牙本質(zhì)區(qū)域齲病的發(fā)生、發(fā)展是牙本質(zhì)敏感患者不容忽視的問(wèn)題。

早期黏附是細(xì)菌生物膜形成過(guò)程中非常重要的步驟，是生物膜發(fā)育和成熟的基礎(chǔ)[7]。影響細(xì)菌在口腔組織黏附的因素很多，包括口腔組織及修復(fù)材料表面性能、細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境等[8]。材料表面性能主要包含粗糙度、疏水性和表面自由能，盡管三者之間可以相互作用，但研究[9]證明粗糙度對(duì)細(xì)菌黏附的影響力大于自由能和疏水性。許多研究[10]也表明，粗糙的表面可促進(jìn)細(xì)菌的黏附。本實(shí)驗(yàn)使用拋光膏及浮石粉處理暴露牙本質(zhì)表面，SEM觀察發(fā)現(xiàn)兩種處理均能有效封閉牙本質(zhì)小管，表面粗糙度也降低，進(jìn)而抑制變異鏈球菌在牙本質(zhì)表面的黏附。

變異鏈球菌是公認(rèn)的主要致齲菌，能以蔗糖為原料，在GTFs作用下合成胞外多糖，從而促進(jìn)細(xì)菌黏附和生物膜形成，因此GTFs被認(rèn)為是齲病發(fā)生的關(guān)鍵[11]。變異鏈球菌的GTFs有3種（GTFB、GTFC、GTFD），對(duì)應(yīng)3種編碼基因（gtfB、gtfC、gtfD）。其中GTFB和GTFC合成水不溶性葡聚糖，與變異鏈球菌蔗糖依賴性黏附密切相關(guān)；GTFD合成水溶性葡聚糖，并非變異鏈球菌蔗糖依賴性黏附所必需[12]。變異鏈球菌gtfB、gtfC、gtfD基因的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，如碳水化合物營(yíng)養(yǎng)源、環(huán)境pH值、細(xì)菌生長(zhǎng)速度等[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示使用含精氨酸的拋光膏后，變異鏈球菌gtfB、gtfC基因表達(dá)水平顯著降低，可能影響葡聚糖的合成，進(jìn)而抑制變異鏈球菌在牙面的附著，從而影響菌斑的形成，減少了致病細(xì)菌的黏附數(shù)量，消除致齲的環(huán)境。這種現(xiàn)象的主要原因可能與精氨酸被口腔內(nèi)多種鏈球菌代謝，通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用產(chǎn)生氨，使得口腔環(huán)境pH值升高有關(guān)[14]。Koo等[15]證實(shí)gtfB和gtfC的基因位點(diǎn)相鄰具有相同的調(diào)控機(jī)制，而gtfD的表達(dá)模式與gtfB和gtfC不同。這可能是抗敏拋光膏組gtfB和gtfC表達(dá)水平均明顯降低，而gtfD表達(dá)卻沒(méi)有明顯變化的原因。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：使用含精氨酸抗敏拋光膏處理能顯著降低變異鏈球菌gtfB和gtfC的表達(dá)，抑制變異鏈球菌在牙本質(zhì)表面的黏附，對(duì)敏感牙本質(zhì)區(qū)域齲病有一定防治作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Cummins D. Dentin hypersensitivity： from diagnosis to a breakthrough therapy for everyday sensitivity relief[J]. J Clin Dent， 2009， 20（1）：1-9.

[2] Love RM， Jenkinson HF. Invasion of dentinal tubules by oral bacteria[J]. Crit Rev Oral Biol Med， 2002， 13（2）：171-183.

[3] Hosoya N， Honda K， Iino F， et al. Changes in enamel sur-face roughness and adhesion of Streptococcus mutans to enamel after vital bleaching[J]. J Dent， 2003， 31（8）：543- 548.

[4] Kleinberg I. A new saliva-based composition for simple and effective treatment of dentinal sensitivity pain[J]. Dent Today， 2002， 21（12）：42-47.

[5] Schiff T， Delgado E， Zhang YP， et al. Clinical evaluation of the efficacy of an in-office desensitizing paste containing 8% arginine and calcium carbonate in providing instant and lasting relief of dentin hypersensitivity[J]. Am J Dent， 2009， 22 Spec No A：8A-15A.

[6] Cury JA， Koo H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms[J]. Anal Biochem， 2007， 365（2）：208-214.

[7] Park J， Song C， Jung J， et al. The effects of surface rough-ness of composite resin on biofilm formation of Streptococ-cus mutans in the presence of saliva[J]. Oper Dent， 2012， 37（5）：532-539.

[8] Marsh PD. Dental plaque as a microbial biofilm[J]. Caries Res， 2004， 38（3）：204-211.

[9] Quirynen M， Bollen CM. The influence of surface rough-ness and surface-free energy on supra- and subgingival pla-que formation in man. A review of the literature[J]. J Clin Periodontol， 1995， 22（1）：1-14.

[10] Almaguer-Flores A， Olivares-Navarrete R， Wieland M， et al. Influence of topography and hydrophilicity on initial oral biofilm formation on microstructured titanium surfaces in vitro[J]. Clin Oral Implants Res， 2012， 23（3）：301-307.

[11] 韓慧， 張向宇， 楊麗杰， 等. 檸檬提取物對(duì)口腔致齲菌生長(zhǎng)影響的研究[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究， 2012， 28（2）：117-120， 124.

Han Hui， Zhang Xiangyu， Yang Lijie， et al. Effect of lemon peel extracts on the growth of cariogenic bacteria[J]. J Oral Sci Res， 2012， 28（2）：117-120， 124.

[12] Kuramitsu HK. Virulence factors of mutans streptococci： role of molecular genetics[J]. Crit Rev Oral Biol Med， 1993， 4（2）：159-176.

[13] Xu X， Zhou XD， Wu CD. Tea catechin epigallocatechin gallate inhibits Streptococcus mutans biofilm formation by suppressing gtf genes[J]. Arch Oral Biol， 2012， 57（6）：678-

683.

[14] Huang X， Exterkate RA， ten Cate JM. Factors associated with alkali production from arginine in dental biofilms[J]. J Dent Res， 2012， 91（12）：1130-1134.

[15] Koo H， Seils J， Abranches J， et al. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2006， 50（2）：542-546.

（本文編輯 杜冰）