HPLC法測定益母草中的黃酮類化合物

翁愛彬 鄭荔莉 方劍英

益母草為唇形科植物益母草的干燥地上全草，全國大部分地區(qū)均有分布，為一年或兩年生草本，在花未全開時采摘，是常用的中藥材，其的干燥成熟果實(shí)也可作為中藥材。益母草性微寒、味辛和微苦，功效具有活血、調(diào)經(jīng)、消水、清熱解毒等［1］。臨床上主要用于心血管疾病、產(chǎn)后瘀痛、血液病、月經(jīng)不調(diào)等［2］，近年來進(jìn)一步擴(kuò)展了益母草的藥用及美容保健價值［3］。益母草化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要為生物堿、黃酮類化合物、二萜類、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類和糖類等［4］。黃酮類化合物具有防癌抗癌作用、抗腫瘤作用、抗心血管疾病、消除自由基和抗氧化作用等生理活性［5］，目前對益母草中黃酮類化合物的測定分析方法有紫外可見分光光度法、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(CE-ED)法和細(xì)管電泳-紫外檢測法。紫外可見分光光度法設(shè)備簡單，但是成分復(fù)雜多樣時容易受到雜質(zhì)的影響。造成一定的誤差，甚至帶來錯誤的結(jié)果。因此不適合益母草中黃酮類成分的含量測定。毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(CE-ED)法毛靈敏度高，準(zhǔn)確性好，是一種可靠的定性定量分析傳統(tǒng)中藥益母草及其制劑中生物活性成分的重要方法，但實(shí)驗條件要求高，操作比價繁瑣。細(xì)管電泳-紫外檢測法重現(xiàn)性好、簡便、快速，準(zhǔn)確率高，但是實(shí)驗室條件要求高，儀器昂貴，在一般的實(shí)驗室測定準(zhǔn)確不高的，故不予推廣。其中高效液相色譜法具有高速、高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，是常用的一種定性定量的分析手段。而采用HPLC法同時測定益母草中蘆丁和槲皮素的方法，目前文獻(xiàn)中報道尚少。因此為了更好的控制益母草的質(zhì)量，本論文采用HPLC同時測定益母草中蘆丁和槲皮素的含量，摸索合適的色譜條件，準(zhǔn)確測量益母草有效成分蘆丁和槲皮素的含量。

1 實(shí)驗儀器與試劑

LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津);KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(功率100 W，頻率40 kHz);六兩裝高速中藥粉碎機(jī)(武義縣屹立工具有限公司);BT25S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

對照品蘆丁(批號:100080-200707，純度:99．9%)，槲皮素(批號:100081-200907，純度:99．9%)，(中國藥品生物制品檢定所);益母草藥材［安徽(凱利)，批號:20100705］。甲醇為純色譜;其他試劑均為分析純;實(shí)驗用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液的制備

2．1．1 供試品溶液的制備:精密稱取用六兩裝高速中藥粉碎機(jī)粉碎的益母草粉末2 g(過20目篩)，置于稱量瓶(30×60)中，加75%乙醇20 ml，用KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(功率100 W，頻率40 kHz)超聲30 min后取出，冷卻后過濾，濾渣再用同方法提取1次，合并兩次的提取液，經(jīng)減壓濃縮得乙醇浸膏;加適量的甲醇溶解所得的乙醇浸膏并轉(zhuǎn)移到5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后用0．45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，取得的續(xù)濾液即為本實(shí)驗的供試品溶液。

2．1．2 混合對照品溶液的制備:精密稱取對照品蘆丁3 mg和槲皮素2 mg，分別放置到標(biāo)記1和2的5 ml棕色量瓶中，加適量的甲醇溶解后繼續(xù)加甲醇稀釋至刻度即可，搖勻，然后再分別用移液槍準(zhǔn)確移取蘆丁和槲皮素的對照品儲備液各4 ml，放置到10 ml容量瓶中，然后加甲醇至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(蘆丁:0．24 mg/ml，槲皮素:0．16 mg/ml)。

2．2 色譜條件 色譜柱:ODS-C18柱 5 μm(150×4．6 mm)，流動相:甲醇-1%乙酸水溶液(55∶45，V/V)溶液系統(tǒng)梯度洗脫，柱溫:30℃，流速:1．0 ml/min，檢測波長:260 nm，進(jìn)樣量:20 μl?；旌蠈φ掌飞V圖見圖1，益母草供試品色譜圖見圖2。

圖1 混合對照品色譜圖(1-蘆丁;2-槲皮素)

圖2 益母草供試品色譜圖(1-蘆丁;2-槲皮素)

2．3 方法學(xué)的考察

2．3．1 線性關(guān)系考察:分別精密量取“2．1．2”項下已制備的混合對照品溶液 0．125，0．25，0．5，1．0，1．5，2．0，3．0 ml至5 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成分別含蘆丁 6、12、24、48、72、96、144 μg/ml和含槲皮素 4、8、16、32、48、64、96 μg/ml的溶液，每份溶液都用0．45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液各進(jìn)樣20 μl，在上述的色譜條件進(jìn)行RP-HPLC分析，以對照品峰面積為縱坐標(biāo)Y，以對照品濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸運(yùn)算，計算得到蘆丁的回歸方程為:y=38906．11x+144016．2，r=0．9984(n=7)，槲皮素的回歸方程為:y=70738．89x+24655．54，r=0．9995(n=7)，結(jié)果表明:蘆丁的進(jìn)樣濃度在6．0～144．0 μg/ml范圍內(nèi)，進(jìn)樣量和峰面積的線性關(guān)系良好，而槲皮素的進(jìn)樣溶度在4．0 ～96．0 μg/ml范圍內(nèi)，進(jìn)樣量和峰面積有良好的線性關(guān)系。用稀釋法進(jìn)行HPLC測定確定本方法的蘆丁和槲皮素的最低檢測限分別為0．1875 μg/ml和 0．25 μg/ml。

2．3．2 精密度實(shí)驗:精密吸取由“2．1．2”項下制備的混合對照品溶液(蘆丁:96．0 μg/ml，槲皮素:64．0 μg/ml)，在“2．2”項下的色譜條件進(jìn)樣20 μl，重復(fù)進(jìn)樣測定6次，蘆丁的6次峰面積平均值為3954153，日內(nèi)RSD為0．24%;槲皮素的6次峰面積平均值為4461044，日內(nèi) RSD為1．51%。精密吸取由“2．1．2”下制備的混合對照品溶液(蘆丁:96．0 μg/ml，槲皮素:64．0 μg/ml)，連續(xù)6 d 在上述的色譜條件下，1 次/d 進(jìn)樣20 μl測定，蘆丁的6次峰面積平均值為 3917046，日間 RSD為1．49%;槲皮素的6次峰面積平均值為4452686，日間RSD為1．66%。結(jié)果顯示表明這個實(shí)驗的精密度良好。

2．3．3 穩(wěn)定性實(shí)驗:吸取分別放置了 0、2、4、8、12、24 h 的供試品溶液，在上述的色譜條件下進(jìn)樣20 μl進(jìn)行測定，蘆丁的峰面積平均值為857625，RSD為1．38%;槲皮素的峰面積平均值為575531，RSD為1．53%。結(jié)果顯示說明益母草供試品溶液在24h之內(nèi)是比較穩(wěn)定的。

2．3．4 加樣回收率實(shí)驗:取已知槲皮素和蘆丁含量的益母草藥材樣品，共3份，精密稱取適量，每份分別準(zhǔn)確加入低、中、高三個水平的槲皮素和蘆丁對照品溶液適量。按“2．1．1”項下的方法制備成待測的供試品溶液，在上述色譜條件下，進(jìn)樣20μL，依法測定并計算槲皮素和蘆丁的平均回收率。見表1。

表1 槲皮素和蘆丁的加樣回收率實(shí)驗結(jié)果

2．4 樣品測定 精密稱取益母草粉末2 g，按“2．1．1”項下的步驟操作，制備成供試品溶液。在上述色譜條件下進(jìn)樣20 μl測定，采用校準(zhǔn)曲線法計算樣品中蘆丁和槲皮素的含量，結(jié)果為益母草藥材中蘆丁和槲皮素的含量分別為0．892 mg/g和0．405 mg/g。

3 討論

3．1 流動相的選擇 分別用甲醇-水(55∶45)、甲醇-1%乙酸水(45∶55)、甲醇-1%乙酸水(55∶45)、甲醇-1%乙酸水(58∶42)溶液系統(tǒng)，對混合對照品進(jìn)行洗脫。結(jié)果顯示甲醇-水(55∶45)溶液洗脫時槲皮素的峰形有明顯的拖峰，甲醇-1%乙酸水(45∶55)溶液洗脫時蘆丁的峰與溶劑峰很接近，甲醇-1%乙酸水(58∶42)溶液洗脫時槲皮素保留時間延長，甲醇-1%乙酸水(55∶45)洗脫時蘆丁和槲皮素的色譜分離度和色譜峰的峰形均好，蘆丁和槲皮素在20 min內(nèi)出峰完畢。所以流動相采用甲醇-1%乙酸水(55∶45)溶液系統(tǒng)。

3．2 流動相流速的選擇 在流動相為甲醇-1%乙酸水(55∶45)，柱溫為30℃的條件下，在0～1．0 ml/min流速下測定混合對照品溶液，對蘆丁和槲皮素的色譜分離進(jìn)行比較。結(jié)果在流速為1．0 ml/min時，色譜峰的分離度和出峰時間均好，故確定流速為1．0 ml/min。

3．3 檢測波長的選擇 蘆丁和槲皮素為黃酮醇苷類和黃酮醇類，在甲醇溶液中的紫外吸收光譜有兩個吸收帶組成，分別在328～385 nm和240～280 nm［6］，在流動相為甲醇-1%乙酸水(55∶45)溶液系統(tǒng)，流速為1．0 ml/min，柱溫為30℃的條件下，實(shí)驗比較了360 nm和260 nm這兩個波長的測定效果，結(jié)果表明槲皮素和蘆丁的混合對照品溶液會在260 nm處得到最大吸收和較好峰形，故確定260 nm為本實(shí)驗的測定波長。

3．4 供試品溶液制備的選擇 通過文獻(xiàn)的查閱，提取黃酮類化合物的方法有微波法［7］、超聲波提取法［8］、酶提取法［9］、乙醇為溶劑索氏提取器提取［10］等，由于實(shí)驗條件的有限，本實(shí)驗采用超聲波提取法，雜質(zhì)比較多使得槲皮素和蘆丁的峰和雜質(zhì)峰沒有實(shí)現(xiàn)基線分離，對實(shí)驗結(jié)果有一定的影響。考察了甲醇、75%乙醇和無水乙醇三種提取溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)75%乙醇作為提取溶劑是提取效果較好，同時也考察了超聲提取時間，最后確定75%乙醇為樣品的提取溶劑，提取時間為30 min。

RP-HPLC法測定益母草中的蘆丁和槲皮素的含量分別為0．892 mg/g和0．405 mg/g，該方法簡便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，是一種較好的含量測定方法，可為益母草中藥材的質(zhì)量控制提供實(shí)驗依據(jù)。

1 蔡少青主編．生藥學(xué)．第5版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2010．277．

2 魏麗春，李慶軍．益母草的藥理與臨床研究進(jìn)展．西北藥學(xué)雜志，2009，24:333-335．

3 申利紅，王勝利．益母草的研究進(jìn)展．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38:4414-4416．

4 阮金蘭，曾慶忠．益母草的化學(xué)、藥理和臨床研究進(jìn)展．中草藥，2003，34:附15-附 18．

5 延璽，劉會青，鄒永青，等．黃酮類化合物生理活性及合成研究進(jìn)展．有機(jī)化學(xué)，2008，28:1534-1544．

6 吳立軍主編．天然藥物化學(xué)．第4版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2007．188．

7 韓秋菊，鮑亞麗．微波法提取木立蘆薈黃酮類化合物的工藝研究．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39:9565-9567．

8 王斌，徐守霞．超聲波輔助法提取鳳尾草中黃酮類化合物的影響因素研究．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50:1878-1879．

9 王悅，肖旭萍．桔皮中提取黃酮類化合物方法的比較分析．食品研究與開發(fā)，2007，38:73-76．

10 鄭敏燕，魏永生．油菜蜂花粉黃酮含量的HPLC測定．分析測試學(xué)報，2004，23:95-97．