布地奈德對(duì)哮喘小鼠IL-23與 Th17細(xì)胞表達(dá)的作用研究

閆曉燕 高曉增 逯春潔 許景偉 張俊玲 趙鳳珍

支氣管哮喘是一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，Th1/Th2失衡理論僅能部分解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制，而最近對(duì)Th17細(xì)胞的研究則完善并補(bǔ)充了哮喘的具體發(fā)病機(jī)制［1］。布地奈德作為一種表面激素，是治療哮喘的主要藥物［2，3］。本研究通過建立小鼠哮喘模型，觀察布地奈德對(duì)小鼠Th17細(xì)胞以及白介素-17(IL-17)和白介素-23(IL-23)表達(dá)的影響，探討其治療哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 8周齡SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠30只，平均體重(20．5±1．2)g，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常組、哮喘組和布地奈德組，每組10只。

1．2 試劑與設(shè)備 卵白蛋白 (OVA，美國Sigma);液態(tài)鋁(上海化學(xué)試劑公司);IL-17和IL-23 ELISA檢測(cè)試劑盒(Bender Medsystem公司);布地奈德霧化吸入混懸液(阿斯利康公司);FACS流式細(xì)胞儀、大鼠抗小鼠熒光抗體標(biāo)記FITC-IL-17、PECD4及紅細(xì)胞裂解液(購自美國美國BD公司)。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 哮喘模型的建立:參照唐配弦的《造血細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》進(jìn)行哮喘模型的制備，于實(shí)驗(yàn)的第1、7天腹腔注射致敏原0．2 ml(由0．01%的 OVA 與液態(tài)鋁各0．1 ml組成)致敏，第14天起給予2．5%OVA溶液霧化吸入，連續(xù)激發(fā)7 d，并同時(shí)給予0．9%氯化鈉溶液0．2 ml腹腔注射，每天1次，連續(xù)7 d。對(duì)照小鼠用等量的0．9%氯化鈉溶液代替OVA。布地奈德組于每次激發(fā)前30 min給予布地奈德霧化吸入20 min(布地奈德0．2 mg)，其他組則用0．9%氯化鈉溶液代替。

1．3．2 肺標(biāo)本制備與支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集:于最后次激發(fā)后12 h內(nèi)腹腔注射l%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，迅速剝離肺臟，結(jié)扎右肺根，取右肺作為標(biāo)本，雙蒸水沖洗甲醛固定后石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色并觀察病理改變;用靜脈留置針行左氣管插管并進(jìn)行灌洗，0．2 ml每次共6次，回收率＞90%，離心后經(jīng)0．9%氯化鈉溶液沖洗并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1．0×109/L，然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)。

1．3．3 流式細(xì)胞檢測(cè):摘取小鼠眼球后取血，每只取抗凝全血100 μl，正常對(duì)照組另取一管100 μl全血，為空白對(duì)照，加紅細(xì)胞裂解液充分裂解后，經(jīng)PBS液洗2次后用PE標(biāo)記抗小鼠CD4抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗小鼠IL-17A抗體及其相匹配的同型對(duì)照抗體，避光染色10 min后上機(jī)檢測(cè)。

1．3．4 含量測(cè)定:ELISA法測(cè)定BALF上清液的IL-17和IL-23含量，操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 肺組織切片 與對(duì)照組小鼠相比哮喘組小鼠支氣管壁明顯增厚，氣道上皮斷裂、脫落，氣道內(nèi)杯狀細(xì)胞肥大增生，且分泌大量黏液及黏液栓形成，支氣管炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，布地奈德組小鼠支氣管的炎癥浸潤(rùn)情況較哮喘組明顯改善。見圖1。

圖1 3組小鼠肺組織病理改變(HE×200)

2．2 3組小鼠左肺BALF白細(xì)胞總數(shù) 對(duì)照組BALF中白細(xì)胞總數(shù)為(1．29±0．16)×105個(gè)，哮喘組為(2．05±0．28)×105個(gè)，布地奈德組為(1．36 ±0．21)×105個(gè)。3組左肺BALF白細(xì)胞總數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，其中哮喘組比正常組、布地奈德組均升高(P＜0．05)。

2．3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠Th17細(xì)胞 哮喘組、布地奈德組外周血Th17細(xì)胞百分比均高于對(duì)照組，而BUD組低于哮喘組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。見圖2。

圖2 外圍血Th17細(xì)胞結(jié)果

2．4 BALF中IL-17和IL-23的含量 哮喘組、布地奈德組BALF中IL-17和IL-23的含量高于對(duì)照組(P ＜0．05);而布地奈德組低于哮喘組(P ＜0．05)。見表1。

表1 3組BALF中IL-17和IL-23含量

3 討論

支氣管哮喘是在多因素共同作用下導(dǎo)致的一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，其本質(zhì)是一種由各種炎性細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥［4］。布地奈德吸入治療能有效地減輕氣道炎癥和治療哮喘，是目前臨床控制哮喘急性期癥狀和緩解期的重要治療方法［5］。本研究顯示，布地奈德組小鼠支氣管及血管周圍炎細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少，支氣管擴(kuò)張程度明顯改善，而且在BALF中白細(xì)胞總數(shù)也較哮喘組明顯減少，表明布地奈德能夠有效抑制氣道的炎性反應(yīng)，從而改善通氣進(jìn)并緩解呼吸困進(jìn)而起到治療哮喘的作用。Th17細(xì)胞是一種不同于Th1/Th2的新細(xì)胞亞群［6］，它的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)哮喘的具體發(fā)病機(jī)制有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。1L-17被認(rèn)為是Th17細(xì)胞產(chǎn)生的最主要的細(xì)胞因子，IL-17可以募集、介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的局部浸潤(rùn)和組織損傷［7］。本研究結(jié)果顯示哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中Th17細(xì)胞的比例顯著增加，并且通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞的比例也顯示哮喘組小鼠的Th17細(xì)胞的比例明顯高于其他2組(P＜0．05)，這提示Thl7細(xì)胞一定參與了哮喘的發(fā)病過程。而在布地奈德組這一改變并不顯著，提示布地奈德的加入減少了Th17細(xì)胞的產(chǎn)生，從而降低了IL-17的分泌，進(jìn)而緩解了哮喘小鼠的炎性反應(yīng)，從而起到了治療哮喘的目的。

本實(shí)驗(yàn)又選擇了IL-23作為檢測(cè)指標(biāo)，IL-23是由樹突狀細(xì)胞和其他抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生，它的生理學(xué)功能主要是通過激活STAT3，在體內(nèi)對(duì)維持Th17細(xì)胞分化發(fā)揮作用，此外IL-23在Th17細(xì)胞的發(fā)育、擴(kuò)增等過程起著關(guān)鍵性的作用［8］。由此可以看出一些與Th17細(xì)胞致病性相關(guān)的疾病治療可以將IL-23作為治療的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示布地奈德組的小鼠的BALF中的IL-23水平明顯低于哮喘組，而且在肺組織病理學(xué)、外周血Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)以及BALF中IL-17水平都與哮喘組存在顯著性差異，這就提示布地奈德的干預(yù)降低了小鼠IL-23的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制了T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化以及擴(kuò)增，從而控制了Th17細(xì)胞的致病性過程，而大體的表現(xiàn)就是小鼠的哮喘癥狀得以控制，哮喘的病情得以改善，由此我們推斷布地奈德治療哮喘的機(jī)制與降低IL-23的表達(dá)水平有關(guān);但是布地奈德組小鼠的檢測(cè)指標(biāo)雖然好于哮喘組，但是仍然低于對(duì)照組，這就提示我們布地奈德雖然可以從某個(gè)靶點(diǎn)對(duì)哮喘的進(jìn)程進(jìn)行干預(yù)，但由于哮喘的具體發(fā)病機(jī)制并未明了，同時(shí)仍然有另外的機(jī)制在發(fā)揮作用，因此出現(xiàn)了與對(duì)照組差異，尤其在BALF中IL-17水平這一指標(biāo)表現(xiàn)的明顯，這為我們的后續(xù)研究提供了新的思路。雖然小鼠與人類Th17細(xì)胞的分化存在差異［9］，小鼠的結(jié)果并不能完全等同于人類，但是無論在鼠還是在人類的Th17細(xì)胞的分化過程中IL-23都是重要的調(diào)控分化因子，故本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以為臨床上布地奈德治療哮喘的機(jī)制提供重要的依據(jù)。

1 Wilson NJ，Boniface K，Chan JR，et al．Development cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells．Nat Immunol，2007，8:950-957．

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