重組氨肽酶底物特異性及協(xié)同水解玉米蛋白質(zhì)

林 穎， 孔 峰， 田亞平

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解以后，水解產(chǎn)物主要為游離氨基酸、寡肽及小分子肽，這些小分子水解產(chǎn)物比大分子蛋白質(zhì)具有更多的良好特性，如穩(wěn)定性、水溶性等理化性質(zhì)，并且其中一些寡肽還具有易吸收、低過(guò)敏原性、抗血壓、抗氧化性，以及降低血脂、膽固醇和抗疲勞等生理功能[1-10]。因此，將蛋白質(zhì)原料水解為游離氨基酸和小分子肽可有效提升蛋白質(zhì)原料的附加值。

酶對(duì)底物的催化作用分為專(zhuān)一性和非專(zhuān)一性，由于蛋白酶對(duì)底物作用不同以及蛋白質(zhì)原料組成不同，不同的蛋白酶水解蛋白質(zhì)的產(chǎn)物也不盡相同。目前酶法水解蛋白質(zhì)原料的酶主要有木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及復(fù)合蛋白酶等，其蛋白質(zhì)的水解度一般在40%左右，水解程度普遍偏低。蛋白質(zhì)的深度水解不僅需要內(nèi)切蛋白酶的作用，還需要外切蛋白酶的協(xié)同作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶具有外切酶活性，而內(nèi)切酶活性相對(duì)較低[11]。故作者考察了重組枯草芽孢桿菌氨肽酶水解小分子底物的特異性，在此基礎(chǔ)上探究了與其適宜的內(nèi)切酶協(xié)同水解玉米蛋白質(zhì)的活力，以便更好地發(fā)揮氨肽酶在蛋白質(zhì)原料水解方面的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重組枯草芽孢桿菌，本課題組從枯草芽孢桿菌Zj016中擴(kuò)增出氨肽酶的基因，并在枯草芽孢桿菌表達(dá)體系中實(shí)現(xiàn)了它的高效分泌表達(dá)[12]。

1.1.2 主要試劑 Leu-pNA、Arg-pNA、Lys-pNA、Ala-pNA、Ile-pNA、Val-pNA、Phe-pNA、Pro-pNA、Glu-pNA，美國(guó)Alfa公司制品；玉米蛋白質(zhì)，山東瑞星集團(tuán)有限公司制品；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司制品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 BCD-208K型低溫冰箱，青島海爾股份有限公司制造；722型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠制造；SHZ-22型電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠制造；himac CR22G高速冷凍離心機(jī)，日本日立（HITACHI）公司制造；氨基酸分析液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司制造；Waters 600型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨肽酶的制備 重組枯草芽孢桿菌氨肽酶的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)8 000 r/min，15 min離心除菌體，上清液中加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的硫酸銨澄清發(fā)酵液，然后8 000 r/min，15 min離心除雜，上清液經(jīng)過(guò)超濾濃縮、脫鹽后，采用體積分?jǐn)?shù)為20%～65%乙醇沉淀氨肽酶，離心沉淀經(jīng)真空冷凍干燥獲得粉狀氨肽酶。

1.2.2 氨肽酶的底物特異性 按照氨肽酶活性測(cè)定方法， 分別以 Leu-pNA、Arg-pNA、Lys-pNA、IlepNA、Phe-pNA、Ala-pNA、Pro-pNA、Val-pNA、GlupNA為底物，測(cè)定該氨肽酶對(duì)9種不同底物的水解能力。

1.2.3 氨肽酶對(duì)不同底物的Km及Vmax測(cè)定 分別以Leu-pNA、Arg-pNA、Lys-pNA為底物，測(cè)定不同底物濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L）時(shí)氨肽酶的酶活。按照Lineweaver-Burk作圖法，計(jì)算該酶對(duì)不同底物的Km和Vmax。

1.2.4 單酶水解玉米蛋白 選用4種蛋白酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶），在表1條件下進(jìn)行單酶水解玉米蛋白質(zhì)。以酶解后的水解度為指標(biāo)，從中選擇出酶解效果較好的內(nèi)切型蛋白酶。

表1 不同蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of various proteases

1.2.5 氨肽酶活力測(cè)定 采用LNA法[13]。測(cè)定時(shí)，首先加入2 mL pH 8.5的Tris-HCl緩沖液和1 mL 1 mg/mL的底物 （L-亮氨酸-4-硝基苯胺L-LeupNA），然后再加入1 mL稀釋一定倍數(shù)的酶液，于50℃下水浴反應(yīng)10 min后，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。酶活力定義：在50℃水浴下，每分鐘分解L-亮氨酸-4-硝基苯胺產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯胺所需酶量定義為一個(gè)酶活單位。

1.2.6 水解度（DH）測(cè)定 采用pH-stat法[14]。

1.2.7 酶解液中游離氨基酸含量的測(cè)定 色譜條件：色譜柱，ODS HYPERSIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A，將 8.0 g結(jié)晶乙酸鈉溶解在 1 L水里，向其中加入0.225 mL的三乙胺，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的醋酸將溶液pH調(diào)至7.2，再加入50 mL四氫呋喃，混合均勻；B，將8.0 g結(jié)晶乙酸鈉溶解在400 mL水里，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的醋酸將溶液的pH調(diào)至7.2，再加入800 mL甲醇和800 mL乙腈，混合均勻。梯度洗脫程序：0～5 min，體積分?jǐn)?shù)92%的A溶液；5～35 min，體積分?jǐn)?shù)8%～100%的B溶液。體積流量為1 mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm。

1.2.8 酶解液中多肽分布的測(cè)定 色譜條件：色譜柱，TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動(dòng)相，乙腈/水/三氟乙酸，體積比45/55/0.1。檢測(cè)波長(zhǎng)為 220 nm；體積流量為 0.5 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。樣品制備：吸取樣品2 mL置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，用0.22 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后供進(jìn)樣。相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C（MW12500）；桿菌酶 （MW1450）；乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（MW451）；乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（MW189）。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨肽酶的底物特異性

用50 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl緩沖液將酶粉稀釋到一定倍數(shù)后進(jìn)行底物特異性的研究，以實(shí)驗(yàn)中酶活力最高的一組作為對(duì)照，結(jié)果如圖1所示。

圖1 重組枯草芽孢桿菌氨肽酶的底物特異性Fig.1 Substratespecificity ofaminopeptidase from recombinant Bacillus subtilis

由圖1可知，在所測(cè)定的9種小分子底物中，該重組枯草芽孢桿菌氨肽酶分解由疏水氨基酸組成的Leu-pNA活力最強(qiáng)，其次是兩種由堿性氨基酸組成的Arg-pNA、Lys-pNA，對(duì)其它幾種疏水氨基酸組 成 的 Ala-pNA、Ile-pNA、Val-pNA、Phe-pNA、Pro-pNA表現(xiàn)出較弱的水解活力，而對(duì)酸性氨基酸組成的Glu-pNA則無(wú)水解活力。

選擇 Leu-pNA、Arg-pNA、Lys-pNA 這 3種底物，分別測(cè)定不同濃度下氨肽酶的酶活，按照Lineweaver-Burk作圖法計(jì)算氨肽酶對(duì)不同底物的米氏常數(shù)Km及其最大反應(yīng)速率Vmax，結(jié)果如表2所示。

表2 氨肽酶對(duì)不同底物的Km和VmaxTable 2 Kmand Vmaxof aminopeptidase of different substrates

由表2可知，通過(guò)3組Km數(shù)據(jù)的比較，氨肽酶對(duì)Leu-pNA的親和力最強(qiáng)，其次是Arg-pNA、LyspNA，與直接分析該酶對(duì)這3種底物水解能力的順序相吻合；此外，3組Vmax的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)氨肽酶完全被底物飽和時(shí)，其對(duì)Leu-pNA的水解速度也是最高。

作者所在課題組前期考察了枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶協(xié)同堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白質(zhì)，通過(guò)考察大豆分離蛋白水解液的苦味值和疏水值指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶具有明顯的脫苦效果[15]。從重組枯草芽孢桿菌氨肽酶底物特異性研究發(fā)現(xiàn)，此酶能夠切除多肽N端的疏水性氨基酸，說(shuō)明氨肽酶在脫除蛋白水解液苦味方面具有較大應(yīng)用潛力。

2.2 蛋白酶的選擇

玉米蛋白質(zhì)的氨基酸組成見(jiàn)表3，其中Leu、Ala、Phe、Val、Pro 等疏水性氨基酸和 Glu 等含量較高，根據(jù)內(nèi)切蛋白酶具備的主要作用位點(diǎn)不同（表4），選擇合適的內(nèi)切酶對(duì)其水解，通過(guò)控制一定水解度可獲得多種小分子肽[16]。

表3 玉米蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of corn protein

表4 4種蛋白酶主要作用位點(diǎn)Table 4 Main active sites of four kinds of proteases

從圖2可知，當(dāng)使用堿性蛋白酶對(duì)玉米蛋白質(zhì)進(jìn)行水解時(shí)，其水解度最高，為23.2%，其它蛋白酶對(duì)玉米蛋白質(zhì)的水解活性均低于堿性蛋白酶。由表3、4可知，玉米蛋白質(zhì)中暴露出堿性蛋白酶的酶切位點(diǎn)（Ala-、Leu、Val、Tyr-、Phe、Trp-）多于其他蛋白酶的酶切位點(diǎn)，所以堿性蛋白酶酶解玉米蛋白質(zhì)的效果最好。

2.3 溫度對(duì)水解度的影響

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的玉米蛋白溶液，堿性蛋白酶加量8.0×103U/g，在不同溫度、pH9.0條件下水解3 h，測(cè)定不同溫度對(duì)水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可知，從40℃上升到50℃的過(guò)程中，在開(kāi)始的80 min內(nèi)，水解度升高非常明顯；而當(dāng)溫度達(dá)到60℃后，在水解開(kāi)始的40 min內(nèi)，水解度是最高的，但是之后隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度降低，原因是溫度偏高，引起了酶活性降低。因此，最適水解溫度為50℃。

圖2 不同蛋白酶的水解度Fig.2 Hydrolysis degree of different proteases

圖3 不同溫度對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of different hydrolysis temperatures on degree of hydrolysis

2.4 pH值對(duì)水解度的影響

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的玉米蛋白溶液，堿性蛋白酶加量8.0×103U/g，在反應(yīng)溫度50℃、不同pH條件下水解3 h，測(cè)定不同pH對(duì)水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同pH值對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of different hydrolysis pH on degree of hydrolysis

由圖4可知，當(dāng)水解液pH為9.0時(shí)，玉米蛋白質(zhì)的水解度最高，為22.3%；當(dāng)pH低于或高于9.0時(shí)，水解度均低于pH 9.0時(shí)的水解度。因此，最適水解pH為9.0。

2.5 底物濃度對(duì)水解度的影響

配制不同濃度的玉米蛋白溶液，堿性蛋白酶加量8.0×103U/g，在溫度 50 ℃、pH 9.0 條件下水解 3 h，測(cè)定不同底物濃度對(duì)水解度的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of different substrate concentration on degree of hydrolysis

由圖5可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)≤10%時(shí)，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，水解度逐漸升高；但是當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到12.5%時(shí)，水解液粘度增大，影響堿性蛋白酶的擴(kuò)散，降低酶的作用效果。因此，最適底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。

2.6 堿性蛋白酶加酶量對(duì)水解度的影響

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的玉米蛋白溶液，在溫度50 ℃、pH 9.0 條件下， 分別按 8.0×103、 1.6×104、3.2×104、4.8×104U/g加入不同量的堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，水解3 h，測(cè)定不同堿性蛋白酶加酶量對(duì)水解度的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同加酶量對(duì)水解度的影響Fig.6 Effect of different enzyme-substrate ratios on degree of hydrolysis

由圖6可知，在相同酶解時(shí)間下，隨著加酶量的增加水解度也逐漸增加；當(dāng)酶底比由8.0×103U/g增加到3.2×104U/g時(shí)，水解度由 40.1%增加到55.3%；然而當(dāng)加酶量增加到4.8×104U/g時(shí)，水解度為58.3%，增加量不明顯?？紤]到成本因素和提高酶的利用價(jià)值，最適酶底比為3.2×104U/g。

2.7 氨肽酶和堿性蛋白酶協(xié)同水解玉米蛋白質(zhì)

由于氨肽酶最佳酶解反應(yīng)溫度為50℃，pH為8.5，與堿性蛋白酶的最佳酶解條件基本一致，并且氨肽酶相對(duì)堿性蛋白酶來(lái)說(shuō)，價(jià)格較高，考慮到成本問(wèn)題，水解過(guò)程中的溫度、pH按照氨肽酶最佳酶解條件進(jìn)行，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解時(shí)間按照堿性蛋白酶水解的最佳條件進(jìn)行。

選用堿性蛋白酶的最佳添加量（3.2×104U/g）及較優(yōu)的水解條件（溫度50℃，pH 8.5，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，水解3 h），通過(guò)改變氨肽酶的添加量，考察不同添加量的氨肽酶與堿性蛋白酶協(xié)同水解玉米蛋白質(zhì)的效果，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同添加量的氨肽酶與堿性蛋白酶協(xié)同水解玉米蛋白質(zhì)Fig.7 Aminopeptidase underdifferentamountsof coordinationwith alkali protease hydrolyzed corn protein

由圖7可知，當(dāng)氨肽酶的添加量≤900 U/g時(shí)，隨著氨肽酶添加量的增加，酶的活性基團(tuán)也增加，酶促反應(yīng)加快，水解度增加的速度較快；隨后繼續(xù)增加氨肽酶添加量，水解度仍然有所提高，但增加幅度較小。因此考慮到成本因素，選擇氨肽酶添加量900 U/g較合適，此時(shí)水解度達(dá)65%。

2.8 單酶和雙酶水解玉米蛋白的比較

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的玉米蛋白溶液，分別添加3.2×104U/g的堿性蛋白酶、900 U/g的氨肽酶，在溫度50℃，pH 8.5條件下水解3 h，將水解液分別進(jìn)行水解度、游離氨基酸、多肽分布分析，考察單酶、雙酶水解玉米蛋白質(zhì)的效果，結(jié)果如表5、6所示。

表5 游離氨基酸組成比較Table 5 Comparison of amino acids composition mg/L

由表5可知，雙酶水解玉米蛋白質(zhì)時(shí)，水解液中新增游離氨基酸含量分別為堿性蛋白酶和氨肽酶單獨(dú)水解的4.89倍、6.05倍；雙酶水解液中Leu含量最高，占總氨基酸的25.32%，其次分別是Ala 11.61% 、Arg 7.99% 、Val 7.74% 、Phe 7.67% 、Glu 6.45%、Ile 6.21%、Tyr 5.79%、Met 5.34%。 蛋白水解液中的苦味主要來(lái)自水解物中的苦味肽，苦味肽一般是肽鏈末端帶有單個(gè)或多個(gè)疏水氨基酸殘基的多肽，苦味正是由這些苦味肽末端的疏水性氨基酸暴露出來(lái)引起的。雙酶水解液中疏水性氨基酸Leu、Ala、Val、Phe、Ile、Tyr含量較高， 說(shuō)明該氨肽酶可以通過(guò)水解苦味肽末端疏水性氨基酸而達(dá)到蛋白水解液的脫苦效果。

由表6可知，未酶解的玉米蛋白溶液中主要是大分子物質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.77%，小肽、寡肽、多肽的含量較低；堿性蛋白酶與氨肽酶單獨(dú)水解玉米蛋白質(zhì)，水解液中大分子物質(zhì)含量減少，小肽含量有一定增多；雙酶復(fù)配水解液中則不存在大分子物質(zhì)，多肽相對(duì)分子質(zhì)量多在1 000 Da以下，其中500～1 000 Da的寡肽占 14.57%，180～500 Da的小肽含量占68.42%，水解度可達(dá)65%。雙酶協(xié)同水解的效果明顯優(yōu)于單酶水解。

表6 相對(duì)分子質(zhì)量分布比較Table 6 Comparison of the molecular weight distribution of the peptides

堿性蛋白酶是疏水專(zhuān)一性?xún)?nèi)切蛋白酶，蛋白質(zhì)經(jīng)其水解后，生成較多末端帶有疏水性氨基酸的多肽，苦味正是由多肽末端的疏水性氨基酸暴露出來(lái)引起的[15]，而該氨肽酶能夠切除這些多肽N端的疏水性氨基酸，堿性蛋白酶水解的主要位點(diǎn)（亮氨酸、丙氨酸等）恰巧是氨肽酶容易水解的疏水氨基酸殘基。這兩種蛋白酶的復(fù)配使用，不僅能夠提高玉米蛋白質(zhì)的水解度、脫除水解液的苦味，還有利于獲得更高比例的小肽。

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)重組枯草芽孢桿菌氨肽酶底物特異性的研究表明，該氨肽酶易水解肽鏈末端帶有疏水氨基酸或堿性氨基酸殘基的多肽，在提高蛋白質(zhì)原料的水解度和脫除蛋白水解液苦味方面具有潛力；該氨肽酶與堿性蛋白酶復(fù)配水解玉米蛋白質(zhì)原料，水解度可達(dá)65%，較單酶水解顯著提高；氨肽酶與堿性蛋白酶的復(fù)配使用，不僅提高了蛋白質(zhì)原料的水解度，還顯著增加了小分子肽的含量，表現(xiàn)出氨肽酶與堿性蛋白酶外切與內(nèi)切活性互補(bǔ)的協(xié)同作用，具有良好的應(yīng)用前景。

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