麥芽糊精硬脂酸酯的酶法合成及其乳化性的研究

孫 平， 楊惠娟， 王雅琦， 劉可志， 徐雅雯

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)，天津 300457）

麥芽糊精也稱水溶性糊精，是一種介于淀粉和淀粉糖之間的水解產(chǎn)物，其水解程度用DE值表示，麥芽糊精的DE值與平均相對分子質(zhì)量成反比，一般小于30，其影響麥芽糊精甜度、粘性、吸濕性、溶解性以及著色性[1]。在麥芽糊精分子中，α-D-吡喃葡萄糖殘基通過α-1，4糖苷鍵連接形成線性長鏈，同時也有少許α-1，6分支點形成的支鏈[2]，但其具體組成主要由生產(chǎn)麥芽糊精所用的原淀粉有關(guān)。同時在組成葡萄糖單位C2、C3、C6的醇羥基反應(yīng)活性較高，因此可以利用一些物質(zhì)的官能團來替代麥芽糊精中該碳位的羥基，從而引入不同的化學(xué)基團，發(fā)生氧化，重排，分子置換，交聯(lián)，酯化等反應(yīng)，以改善麥芽糊精的性質(zhì)[3-4]。酶法酯化麥芽糊精產(chǎn)品是一種用生物催化劑生產(chǎn)的變性糊精，它是通過脂肪酶的作用對糊精進行修飾，酶法合成具有反應(yīng)條件溫和，選擇性高，能耗低，副產(chǎn)物少[5]，排污小[6-7]等優(yōu)點，具有一定的研究價值。麥芽糊精本身為親水性分子，不具有乳化性，如果通過反應(yīng)引入脂肪酸鏈等疏水性官能團，則可以賦予其雙親性質(zhì)，使其具有乳化效果[8-9]，如圖1，再加上其無毒，無臭，無皮膚刺激等性質(zhì)[10]，麥芽糊精硬脂酸酯可作為乳化劑、穩(wěn)定劑、增稠劑等廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥[11]、日化[12]等行業(yè)。作者以DE值為18的麥芽糊精為原料，與硬脂酸通過酶法反應(yīng)制得硬脂酸糊精酯，該產(chǎn)物、方法尚未見相關(guān)報道。合成麥芽糊精硬脂酸酯的反應(yīng)式如圖2所示，通過單因素及正交試驗確定較佳的合成工藝條件并初步研究了產(chǎn)物的乳化性能。

圖1 糊精酯結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of the dextrin fatty acid ester

圖2 麥芽糊精硬脂酸酯反應(yīng)式Fig.2 Lipase-catalyzed synthesis pathway of dextrin fatty acid ester

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試劑：麥芽糊精（DE值為18），硬脂酸，氫氧化鈉，鹽酸，無水乙醇，乙醇（體積分數(shù)95% ），正己烷，叔丁醇均為分析純試劑；Novozym435固定化脂肪酶：10000PLU/g，諾維信公司提供。

儀器：超級恒溫水浴攪拌器：天津市歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；振蕩器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；傅里葉變換紅外光譜儀：德國布魯克儀器公司產(chǎn)品；離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品；pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 叔丁醇中酶催化合成硬脂酸麥芽糊精酯在平底燒瓶中，加入一定量叔丁醇，1～3 g麥芽糊精，2～4 g 脂肪酸，0.4～0.6 g Novozym435 固定化脂肪酶，3Ao分子篩。于恒溫水浴鍋中，在60～70℃條件下，磁力攪拌反應(yīng)48～72 h。反應(yīng)完成后取出反應(yīng)液抽濾，取濾液旋蒸后在剩余物中加入無水乙醇，取上清液旋蒸，將乙醇除去后在剩余液中倒入正己烷，離心，取沉淀干燥即得產(chǎn)物。

1.2.2 正交實驗 選用脂肪酸與糊精質(zhì)量比，酶添加量，反應(yīng)時間，反應(yīng)溫度為考察因素，以DS值作為考察指標，采用L9（34）正交表進行試驗，因素水平列于表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table 1 L9（34）Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 取代度的測定 稱取2.0 g產(chǎn)物置于碘量瓶中，加入50 mL蒸餾水，20 mL 0.25 mol/L的標準NaOH溶液，置于振蕩器中，在110 r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩2 h后，加入兩滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L的標準HCl溶液滴定至粉紅色剛好消失，記錄耗用鹽酸的體積數(shù)V1。同時進行空白試驗記錄空白耗用鹽酸的體積數(shù)V0。并根據(jù)下面的公式計算硬脂酸糊精酯的取代度（DS）。

式中：DS為取代度，定義為每個D-吡喃葡萄糖殘基中的羥基被取代的平均數(shù)目；ω為硬脂?；|(zhì)量分數(shù)，%；162為葡萄糖酐 （AGU）單元的摩爾質(zhì)量，g/mol；266 為硬脂酰基 CH3（CH2）16CO-的相對分子質(zhì)量；c為標準HCl的摩爾濃度，mol/L；m為原料干樣品的質(zhì)量，g；V0為滴定空白液用去的標準鹽酸的體積，mL；V1為滴定樣品用去的標準鹽酸的體積，mL。

1.2.4 乳化性的測定 將取代度均為0.015的麥芽糖硬脂酸酯，淀粉硬脂酸酯（糊化后），麥芽糊精硬脂酸酯樣品用蒸餾水配成質(zhì)量分數(shù)分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%的溶液。取其中的10 mL糖酯溶液和5 mL大豆油加入到30 mL離心管中，用高速均質(zhì)分散器10 000 r/min均質(zhì)1 min。均質(zhì)結(jié)束后將乳狀液靜置1 h后3 000 r/min離心5 min，記錄試管中乳化層的高度（h1，mm）和乳狀液的總高度（h2，mm）。糖酯溶液的乳化性采用以下方程計算[13]。取5次平行測量的平均值。

式中：h1為乳化層的高度，mm；h2為乳狀液的總高度，mm。

1.2.5 糖酯乳狀液的顯微鏡觀察 將5 mL油與10 mL質(zhì)量分數(shù)1%的酯樣品調(diào)配成混和液，以5 mL油與10 mL的蒸餾水作空白。然后用均質(zhì)分散器10 000 r/min均質(zhì)1 min。分別將乳狀液均勻地涂布于潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，用顯微鏡于×100物鏡下觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗研究

2.1.1 脂肪酸酸與糊精質(zhì)量比對產(chǎn)品取代度的影響 在平底燒瓶中，加入叔丁醇，一定量的麥芽糊精，硬脂酸與麥芽糊精的質(zhì)量比分別為0.25、0.5、1、2、3、4、5、6。其他條件為 0.7 g Novozym435 固定化脂肪酶，3Ao分子篩。于恒溫水浴鍋中，在65℃條件下，磁力攪拌反應(yīng)60 h。由圖3可得，DS值隨著脂肪酸與糊精質(zhì)量比的增大而增大，在比值為4的時候達到最大值。比例過高或過低均會導(dǎo)致其DS值的下降。2.1.2 酶添加量對產(chǎn)品取代度的影響的影響 在平底燒瓶中，加入一定量叔丁醇，3 g麥芽糊精，12 g脂肪酸，3Ao分子篩，Novozym435固定化脂肪酶的添加量分別為 3、4、5、6、7、8 g／L。 于恒溫水浴鍋中，在65℃條件下，磁力攪拌反應(yīng)60 h。如圖4所示，DS值隨著酶的添加量的增大而的增大，在添加量為7 g／L的時候基本達到最大值，繼續(xù)增大加酶量，對其基本影響不大，說明此時反應(yīng)已經(jīng)達到了平衡。

圖3 脂肪酸與糊精質(zhì)量比對產(chǎn)品取代度的影響的影響Fig.3 Effect of molar ratio of acid/dextrin on DS

圖4 酶添加量對產(chǎn)品取代度的影響的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on DS

2.1.3 反應(yīng)時間對產(chǎn)品取代度的影響的影響 在平底燒瓶中，加入一定量叔丁醇，3 g麥芽糊精，12 g脂肪酸，0.7 g Novozym435 固定化脂肪酶，3Ao分子篩。于恒溫水浴鍋中，在65℃條件下，磁力攪拌反應(yīng)時間分別為 12、24、48、60、72、90 h。 由圖 5 可知，DS值隨著酶的反應(yīng)時間的增大而的增大，反應(yīng)初始時，由于底物在有機溶劑中溶解度較低，導(dǎo)致底物不能迅速與酶作用結(jié)合，使得反應(yīng)速率較低。隨著反應(yīng)的進行，分子篩吸收了反應(yīng)生成的水，破壞了反應(yīng)平衡，從而使得此時反應(yīng)正向進行，在反應(yīng)時間為60 h時基本趨于平穩(wěn)，繼續(xù)延長時間，對其基本影響不大。

圖5 反應(yīng)時間對產(chǎn)品取代度的影響Fig.5 Effect of reaction time on DS

2.1.4 反應(yīng)溫度對產(chǎn)品取代度的影響的影響 在250 mL平底燒瓶中，加入100 mL叔丁醇，3 g麥芽糊精，12 g脂肪酸，0.7 g Novozym435固定化脂肪酶，3Ao分子篩。 于恒溫水浴鍋中，分別在 50、55、60、65、70、75℃條件下，磁力攪拌反應(yīng)60 h。由圖6可知，由于溶劑的沸點及對底物溶解性以及脂肪酶的活性的影響。體系溫度低于60℃時，產(chǎn)品DS值隨著溫度的升高而提高，溫度升高有利于溶劑對溶質(zhì)的溶解，反應(yīng)底物的相互擴散結(jié)合以及酶活性的激發(fā)；在60～70℃時，DS值可達到最高，繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，溫度過高，酶則會變性失活，失去催化能力DS值會降低。

圖6 反應(yīng)溫度對產(chǎn)品取代度的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on DS

2.2 麥芽糊精硬脂酸酯合成最佳工藝的篩選

在單因素的基礎(chǔ)上，以脂肪酸與糊精的質(zhì)量比量，酶添加量，反應(yīng)時間，反應(yīng)溫度4因素進行L9（34）正交試驗，不同處理重復(fù)3次，試驗結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 2 Results of perpendicular experiment

數(shù)據(jù)分析表明，各因素對DS值的影響順序為B＞A＞D＞C，影響因素的顯著程度大小為：酶添加量>酸糖質(zhì)量比>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時間度。極差分析最優(yōu)組合為A3B3C2D2；故對A3B3C2D2與A3B3C2D3兩組合進行試驗。

表3 最優(yōu)組合驗證試驗Table 3 Validation test of optimal combination

結(jié)果表明，兩種組合產(chǎn)物均得到較高DS值的麥芽糊精硬脂酸酯，但組合A3B3C2D2略優(yōu)于A3B3C2D3，麥芽糊精硬脂酸酯的最佳合成條件為：硬脂酸與糊精比為4，酶添加量為7 g／L，反應(yīng)時間為60 h，反應(yīng)溫度為65℃。

2.3 酯化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

紅外光譜分析儀是有機高分子物質(zhì)分析的重要工具，利用有機化合物中官能團在中紅外區(qū)的選擇性吸收，可對有機物的結(jié)構(gòu)，官能團進行分析測定，不同的物質(zhì)含有特定的基團，因此可以對物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行定性判斷。紅外光譜分析采用KBr壓片法，用紅外光譜儀測定。

制備硬脂酸麥芽糊精酯，理論上硬脂酸通過引入羰基集團使糊精變性，利用紅外光譜可以判斷引入的集團是否與糊精上的羥基相連，麥芽糊精以及麥芽糊精硬脂酸酯紅外光譜圖如下。

圖7 麥芽糊精以及麥芽糊精硬脂酸酯的IR色譜圖Fig.7 Fourier-transform infrared spectra of dextrin and dextrin ester

由圖7可知，1 731.88 cm-1處出現(xiàn)酯羰基[14]的特征吸收峰，同時糊精酯中-OH的吸收峰明顯低于原糊精，這是由于麥芽糊精中的一部分-OH被酯形成羰基，使-OH總體數(shù)量減少，同時在2 849.950 cm-1處出現(xiàn)脂肪族的吸收峰也是其佐證[15]。

2.4 乳化性的測定

糖酯類物質(zhì)能與食品中的類脂、蛋白質(zhì)和碳水化合物等相互作用，使其分散、均勻混合、流變性變好，從而改進和提高食品的質(zhì)量。這與糖酯的乳化性有很大關(guān)系。

研究了不同質(zhì)量分數(shù)對麥芽糊精硬脂酸酯、麥芽糖硬脂酸酯、淀粉硬脂酸酯乳化性的影響。圖8表明，3種糖脂均具有乳化性，隨著糖酯質(zhì)量分數(shù)由0.2%升至1.0%的過程中，糖酯的質(zhì)量分數(shù)越高，乳化程度越大。在相同濃度下，麥芽糊精硬脂酸酯的乳化性最佳，麥芽糖硬脂酸酯次之，淀粉硬脂酸酯最差。原因是隨著疏水長碳鏈的引入，使原本親水的糖具有了親水和親油的集團，具有雙親性質(zhì)。

圖8 麥芽糊精硬脂酸酯、麥芽糖硬脂酸酯、淀粉硬脂酸酯的乳化能力Fig.8 Emulsifying capacity of dextrin ester，maltose ester and starch ester

2.5 糖酯乳狀液的顯微鏡觀察

糖酯分子分別含有親油基和親水基，可阻止分散質(zhì)的小液滴相互凝結(jié)，從而可使油水形成微乳化液。通過顯微觀察可以明顯看出這一現(xiàn)象。

圖9 麥芽糊精硬脂酸酯，麥芽糖硬脂酸酯，淀粉硬脂酸酯的顯微鏡觀察圖Fig.9 Microscope photographs of dextrin ester （b），maltose ester（c）and starch ester（d）

圖9 中（a）、（b）、（c）、（e）分別為空白對照和麥芽糊精硬脂酸酯，麥芽糖硬脂酸酯和淀粉硬脂酸酯乳狀液的顯微鏡觀察圖。未加酯的油水乳狀液只可觀察到大的油滴，表明在不加乳化劑的情況下，即使經(jīng)過高速均質(zhì)后，油水仍不能形成均一的狀態(tài)。而加酯的油水乳狀液分散成了均勻細小的液滴，加麥芽糖硬脂酸酯以及麥芽糊精硬脂酸酯的兩組液滴更均勻些，其分散效果優(yōu)于淀粉硬脂酸酯。

3 結(jié)語

1）考察了脂肪酸與糊精質(zhì)量比、酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間對產(chǎn)物取代度的影響，得到麥芽糊精硬脂酸酯的較佳合成工藝條件：酸糖質(zhì)量比為4∶1，酶添加量為 7 g／L，反應(yīng)溫度 65 ℃，反應(yīng)時間60 h。

2）酯化物質(zhì)量分數(shù)增加，乳液穩(wěn)定性增加。在相同質(zhì)量分數(shù)下，麥芽糊精硬脂酸酯的乳化性最佳，麥芽糖硬脂酸酯次之，淀粉硬脂酸酯最差。

[1]Marchal L M，Beeftink H H，Tramper J.Towards a rational design of commercial maltodextrins[J].Food Science and Technology，1999，10（11）：345-355.

[2]Dokic L，Jakovljevic J，Dokic P.Relation between viscous characteristics and dextrose equivalent of maltodextrins[J].Starch，2004，56（11）：520-525.

[3]張艷萍.變性淀粉制造與應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

[4]鄭茂強.木薯交聯(lián)酯化麥芽糊精的制備、結(jié)構(gòu)及性能研究[D].無錫：江南大學(xué)，2007.

[5]Blecker C，Danthine S，Pétré M，et al.Enzymatically prepared N-alkyl esters of glucuronic acid：the effect of freeze-drying conditions and hydrophobic chain length on thermal behavior[J].Colloid and Interface Science，2008，321（1）：154-158.

[6]張曉鳴，周健，劉巧瑜，等.有機相脂肪酶催化合成技術(shù)在食品及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006，25（1）：120-126.ZHANG Xiao-ming，ZHOU Jian，LIU Qiao-yu，et al.Application of lipase-catalyzed synthesis in prganic solvent for food and related industry[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2006，25（1）：120-126.（in Chinese）

[7]Kaewprapan K，Tuchinda P，Marie E，et al.Ph-imprinted Lipase catalyzed synthesis of dextran fatty acid ester[J].Journal of Mol Catalysis B：Enzymatic，2007，47（3-4）：135-142.

[8]徐婉瀾，尹紅，陳志榮.辛烯基琥珀酸糊精酯的制備與性能研究[J].中國食品學(xué)報，2007，7（6）：64-70.XU Wan-lan，YIN Hong，CHEN Zhi-rong.Research on the preparation and property of octenyl succinic dextrin ester[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2007，7（6）：64-70.（in Chinese）

[9]E Rotureau，E Marie，M Leonard，et al.From polymeric surfactants to colloidal systems （2）：preparation of colloidal dispersions[J]Colloid and Surfaces A：Physicochemical and Engineering，2006，288（1-3）：62-70.

[10]Habulin M，Kabeder S，Knez L.Enzymatic synthesis of sugar fatty acid esters in organic solvent and in supercritical carbon dioxide and their antimicrobial activity[J].The Journal of Supercritical Fluids，2008，45（3）：338-345.

[11]Ferrer M，Soliveri J，Plou F，et al.Synthesis of sugar esters in solvent mixtures by lipases from thermomyces lanuginosus and candida antarcticab，and their antimicrobial properties[J].Enzyme and Microbial Technology，2005，36（4）：391-398.

[12]胡飛，孟繁世.辛烯基琥珀酸淀粉酯的流變性質(zhì)（Ⅰ）[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2005，24（2）27-29.HU Fei，MENG Fan-shi.Rheological properties of starch octenyl succinate anhydride[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2005，24（2）27-29.（in Chinese）

[13]Soultani S，Ognier S，Engasser J M，et al.Comparative study of some surface active properties of fructose esters and commercial sucrose esters[J].Colloids and Surfaces A：Physicochemical and Engineering Aspects，2003，227（1-3）：35-44.

[14]張晶.酯化麥芽糊精的制備及其特性研究[D].鄭州：河南工業(yè)大學(xué)，2010.

[15]徐愛國.硬脂酸玉米淀粉酯的制備、性質(zhì)及應(yīng)用[D].無錫：江南大學(xué)，2004.