福爾可定原料藥中有關物質(zhì)測定方法的建立

趙學剛，馮雅慧，康海霞，滑千里，王乃浩（河北奧星集團藥業(yè)有限公司，石家莊 050700）

福爾可定與磷酸可待因作用相似，具有中樞性鎮(zhèn)咳作用，也有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，但成癮性較磷酸可待因弱，主要用于劇烈咳嗽和中度疼痛。新生兒和兒童易耐受此藥，不致引起便秘和消化紊亂[1]。臨床上已有的制劑有福爾可定片、復方福爾可定糖漿、復方福爾可定口服溶液。福爾可定已被2010年版《中國藥典》（二部）、《歐洲藥典》7.0版收載?！吨袊幍洹穂2]中本品采用薄層色譜（TLC）方法進行有關物質(zhì)檢查，采用化學比色法進行嗎啡的檢查，專屬性較差?！稓W洲藥典》7.0版[3]采用高效液相色譜（HPLC）法的主成分自身對照法進行有關物質(zhì)檢查，但該方法不能檢出工藝雜質(zhì)N-（β-氯乙基）嗎啉鹽酸鹽（CMH，因其無紫外吸收）；同時嗎啡和可待因的校正因子均不在0.95～1.05范圍內(nèi)，因此，用主成分自身對照法測定結果不夠準確。為了嚴格控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者在此基礎上，對福爾可定的有關物質(zhì)檢查進行了系統(tǒng)研究，確定采用HPLC外標法測定已知雜質(zhì)嗎啡、可待因，主成分自身對照法測定未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)；采用氣相色譜（GC）外標法測定工藝雜質(zhì)CMH；同時參考2010年版《中國藥典》（二部）、《歐洲藥典》7.0版、ICH（人用藥品注冊技術規(guī)范的國際協(xié)調(diào)會）指導原則[4]制定了本品有關物質(zhì)的檢查限度。

1 材料

e2695型HPLC儀，配置2998二極管陣列檢測器（DAD）（美國Waters公司）；6890N型GC儀（美國Agilent科技儀器有限公司）；CPA225D電子天平（德國Sartorius公司）。

樣品：福爾可定原料藥（河北奧星集團藥業(yè)有限公司，批號：050901、050902、050903、061101、061102、061103，純度：99.86%、99.85%、99.86%、99.87%、99.88%、99.87%）；福爾可定對照品（批號：171205-200504，純度：99.8%）、嗎啡對照品（批號：171201-200521，純度：99.2%）、磷酸可待因?qū)φ掌罚ㄅ枺?71203-200504，純度：99.5%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；CMH對照品（美國Sigma-Aldrich公司，批號：15803DH，純度：99.9%）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 HPLC檢查有關物質(zhì)

2.1.1 色譜條件。色譜柱：Phenomenex苯基己基柱（75 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相：乙腈-四氫呋喃-0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液[量取80.0 ml氫氧化鈉溶液（0.02 mol/L）和100.0 ml的磷酸二氫鉀溶液（0.02 mol/L），置于1 000 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻]（75∶50∶875，V/V/V），用氫氧化鈉溶液（0.2 mol/L）調(diào)整pH值至7.9±0.05，流速：1.0 ml/min；檢測波長：238 nm；進樣量：20 μl；柱溫：35 ℃。

2.1.2 供試品溶液的制備。精密稱取樣品約50 mg，置于50 ml量瓶中，用混合溶劑（量取80 ml乙腈，置于1 000 ml量瓶中，用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻）溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 對照溶液的制備。精密量取“2.1.2”項供試品溶液1 ml置于100 ml量瓶中，加混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.4 對照品溶液的制備。精密稱取嗎啡對照品、磷酸可待因?qū)φ掌愤m量，加混合溶劑溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含嗎啡10 μg、磷酸可待因26.5 μg（約相當于可待因20 μg）的溶液，作為對照品溶液。

2.1.5 專屬性試驗。精密稱取樣品約50 mg，共5份，分別進行強酸（鹽酸1 mol/L）、強堿（氫氧化鈉1 mol/L）、氧化（30%雙氧水）、光照、高溫（105℃，2 h）破壞處理后，用混合溶劑溶解并稀釋制成1 mg/ml的溶液，分別精密量取續(xù)濾液20 μl注入色譜儀，同時進行DAD掃描，掃描范圍為200～400 nm波長。結果表明，福爾可定與已知雜質(zhì)分離較好，在各破壞條件下，主成分與降解產(chǎn)物能夠得到良好分離，故本品中有關物質(zhì)的檢測方法專屬性良好。

2.1.6 供試品溶液的穩(wěn)定性。按“2.1.2”項下方法配制供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h量取20 μl，注入色譜儀，記錄福爾可定峰面積。結果RSD＝0.12%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 回收率試驗。分別精密稱取樣品9份，置于50 ml量瓶中，分別加入含嗎啡10.12 μg/ml、磷酸可待因20.30 μg/ml的對照品溶液4、4、4、5、5、5、6、6、6 ml，溶液稀釋至刻度，濾過，進樣，測定其含量，計算回收率。回收率試驗結果見表1。

表1 嗎啡、可待因回收率試驗結果（n＝9）Tab1 Results of recovery tests of morphine and codeine（n＝9）

2.1.8 線性范圍的確定。分別精密量取含嗎啡10 μg/ml、磷酸可待因20 μg/ml的對照品溶液2、4、5、6、7、10 ml，置于50 ml量瓶中，用混合溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過。進樣測定，分別記錄嗎啡、可待因的色譜峰面積。將峰面積（y）與各自的質(zhì)量濃度（x）作線性回歸，計算嗎啡、可待因的線性方程。結果分別為嗎啡：y＝17 598x－183.12（r＝0.999 4），可待因：y＝18 585x－1 020.3（r＝0.999 1）。表明嗎啡和磷酸可待因檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.404 6～2.023 2、0.812 2～4.060 8 μg/ml。

2.1.9 定量限、檢測限。取“2.1.4”項下對照品溶液，逐步進行稀釋，然后進樣，掃峰高為基線噪聲的10倍計算定量限。結果，嗎啡、可待因的定量限分別為0.2、0.4 μg/ml。

配制福爾可定對照品溶液，逐步進行稀釋，然后進樣，掃峰高為基線噪聲的3倍計算，福爾可定的檢測限為2.03 ng。

2.1.10 方法精密度試驗。精密量取含嗎啡1 μg/ml、磷酸可待因 2 μg/ml的對照品溶液 20 μl，連續(xù)測定 6 次。結果嗎啡的RSD＝1.23%，可待因的RSD＝1.46%，表明本法精密度較好。

2.1.11 有關物質(zhì)的測定結果。取6批樣品測定，結果見表2，其中061101批樣品色譜圖見圖1。

表2 6批樣品中有關物質(zhì)測定結果Tab2 Results of content determination of related substances in 6 batches of samples

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.樣品；1.嗎啡；2.可待因；3.福爾可定Fig1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.sample；1.morphine；2.codeine；3.pholcodine

2.2GC法檢查CMH

2.2.1 色譜條件。色譜柱：6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細管柱（30 m×530 μm，3 μm），型號：J&W DB-624；柱溫：160 ℃；運行時間：10 min；檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；檢測器溫度：280℃；檢測器氣源組成比例：氮氣-氫氣-空氣（30∶30∶400）；進樣口溫度：250 ℃；分流比：10∶1；載氣：氮氣；流量：4.0 ml/min；進樣量：1.0 μl。

2.2.2 供試品溶液的制備。精密稱取樣品適量，用甲醇溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含50 mg的溶液。

2.2.3 CMH對照品貯備液的制備。精密稱取CMH約50 mg，置于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 CMH對照品溶液的制備。精密量取對照品貯備液5 ml，置于50 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 專屬性試驗。取樣品約0.50 g，精密稱定，共5份，分別進行氧化（30%雙氧水）、光照、高溫（105℃，2 h）破壞處理，然后轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1.0 μl，直接進樣注入氣相色譜儀。結果表明本品在氧化、光照、高溫破壞條件下，CMH與降解產(chǎn)物能夠得到良好分離。

甲醇、乙醇、苯、丁醇和甲苯是福爾可定合成工藝中用到的有機溶劑，因此還需要在本次試驗色譜條件下考察5種殘留溶劑對CMH測定的專屬性：分別精密量取甲醇、乙醇、苯、丁醇和甲苯、CMH對照品適量，分別按“2.2.1”項下色譜條件直接進樣，記錄色譜圖，詳見圖2。

圖2 殘留溶劑檢測氣相色譜圖A.甲醇；B.乙醇；C.丁醇；D.甲苯；E.苯；F.CMHFig2 GC chromatograms of residual solventsA.methanol；B.ethanol；C.butanol；D.toluene；E.benzene；F.N-（βchloroethyl）morpholine hydrochloride

以上試驗表明，福爾可定、嗎啡、可待因以及5種殘留溶劑均不會干擾CMH的測定。在氧化、高溫、光照破壞條件下，CMH與降解產(chǎn)物能夠得到良好分離，故此有關物質(zhì)檢測方法專屬性良好。

2.2.6 供試品溶液的穩(wěn)定性。按“2.2.2”項下方法配制供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8 h精密量取1.0 μl，直接進樣，記錄CMH的峰面積。結果，RSD＝2.57%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 線性范圍的確定。分別精密量取CMH對照品貯備液1、2、4、5、7、10 ml置于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄CMH的峰面積。將峰面積（y）與各自的質(zhì)量濃度（x）作線性回歸，并計算標準曲線方程，結果為y＝645.37x+0.137 4（r＝0.999 7），表明CMH檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.010 1～0.100 9 mg/ml。

2.2.8 精密度試驗。精密量取CMH對照品溶液1.0 μl，直接進樣，連續(xù)測定6次。結果RSD＝1.69%，表明本方法精密度較好。

2.2.9 重復性試驗。按“2.2.2”項下方法配制6份供試品溶液，分別精密量取1.0 μl，直接進樣。結果RSD＝2.08%，表明本法重復性較好。

2.2.10 方法回收率試驗。稱取已知雜質(zhì)含量的樣品約0.5 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，共9份，分別加甲醇使溶解，再分別精密加入CMH貯備液0.8、1.0、1.2 ml，各3份，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取1.0 μl，直接進樣，記錄色譜圖。按外標法計算回收率，結果見表3。

2.2.11 CMH定量限的測定。制備CMH對照品溶液，逐步進行稀釋，然后進樣，掃峰高為基線噪聲的10倍計算，結果其定量限為 5.0 μg/ml。

表3 CMH回收率試驗結果（n＝9）Tab3 Results of recovery tests of CMH（n＝9）

2.2.12 有關物質(zhì)的測定結果。取6批樣品，分別按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結果CMH含量分別為0.039%、0.040%、0.036%、0.028%、0.026%、0.029%，其中061101批樣品色譜見圖3。

圖3 有關物質(zhì)CMH測定氣相色譜圖A.供試品；B.對照品；1.CMHFig3 GC chromatograms of related substance CMHA.test sample；B.control；1.CMH

3 討論

（1）因沒有市售的可待因?qū)φ掌?，筆者用磷酸可待因?qū)φ掌反婵纱驅(qū)φ掌?，在計算可待因含量時應乘以換算系數(shù)0.753 4（299.36/397.36）。

（2）根據(jù)供試品實測結果及歐洲藥典7.0版福爾可定原料藥質(zhì)量標準（嗎啡≤0.2%，可待因≤0.2%，未知雜質(zhì)≤0.1%，總雜質(zhì)≤0.7%），同時根據(jù)2010年版《中國藥典》福爾可定檢查項下嗎啡的雜質(zhì)限度（嗎啡≤0.1%）以及ICH指導原則相關內(nèi)容，本著嚴格控制藥品質(zhì)量的目的，暫定本品的有關物質(zhì)限度為嗎啡不得過0.1%，可待因不得過0.2%，未知雜質(zhì)不得過0.1%，總雜質(zhì)不得過0.7%。

（3）根據(jù)供試品實測結果及ICH指導原則相關內(nèi)容，福爾可定的最大日用量小于2 g，檢定限度為0.10%，為了嚴格控制藥品質(zhì)量，暫定本品中的CMH限度為不得過0.10%。

[1]陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學[M].16版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：427.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1 092.

[3]歐洲藥品質(zhì)量委員會.歐洲藥典7.0[S].法國：斯特拉斯堡，2010：2 724-2 725.

[4]周海鈞.藥品注冊的國際技術要求：質(zhì)量部分[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：99-110.