微生物法檢測(cè)乳粉中抗生素殘留的構(gòu)建

王超逸，馬 凱，王勇軍

(浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300)

抗生素作為有效防病治病藥物在禽畜及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中已被廣泛應(yīng)用，但抗生素的濫用不可避免地造成禽肉和水產(chǎn)品中抗生素殘留超標(biāo)。當(dāng)前，抗生素是動(dòng)物性食品安全中最常見和最重要的污染源。人長(zhǎng)期攝入含抗生素的食品后，不斷在人體內(nèi)積累，最后導(dǎo)致人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)、細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、菌群失調(diào)，更加嚴(yán)重的危害如氯霉素能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥及新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等［1］，嚴(yán)重危害身體健康。因此，尋求簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、敏感性高的檢測(cè)方法，加強(qiáng)動(dòng)物源性食品抗生素殘留快速檢測(cè)及監(jiān)控是當(dāng)前食品安全的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

抗生素殘留檢測(cè)方法主要有微生物檢測(cè)法、色譜法和免疫分析法等方法［2-4］，當(dāng)前應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)方法為免疫分析法靈敏度高，但是檢測(cè)成本要求較高，只能檢測(cè)單一抗生素，不易于推廣。本研究利用微生物生長(zhǎng)抑制原理以及微生物生長(zhǎng)后酸堿度變化的規(guī)律，建立了一種簡(jiǎn)易高效抗生素檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌種與乳粉樣品

供試菌種為嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus sterothermophilus)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (10208)。脫脂乳粉和全脂無抗乳粉由國(guó)家乳品檢測(cè)中心提供。

1.1.2 試劑

青霉素G、土霉素、鏈霉素和頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自AMRESCO 公司，溴百里酚納、溴甲酚紫及其他試劑均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)貯備液:精密稱取青霉素G、土霉素、鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品各0.25 g，分別用超純水溶解并定容至25 mL，濃度均為10 mg·mL-1。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g;酵母粉5 g;氯化鈉10 g;瓊脂15 g 溶于蒸餾水中，用NaOH 溶液調(diào)pH 值7.0，最后定容至1 000 mL，分裝于錐形瓶中，121℃下高壓滅菌20 min。

液體產(chǎn)孢培養(yǎng)基:牛肉膏5 g;蛋白胨3 g;氯化鈉5 g;蒸餾水1 000 mL，用NaOH 溶液調(diào)pH 值為7.0，分裝于錐形瓶中，121℃下高壓滅菌20 min。培養(yǎng)前，加入0.5 g 的MgSO4，制成產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

檢測(cè)培養(yǎng)基:蛋白胨5 g;葡萄糖10 g;酵母粉2 g;指示劑0.03 g;蒸餾水定容至1 000 mL，pH 值調(diào)至7.5，分裝于錐形瓶中，121℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的培養(yǎng)

利用平板劃線法，將菌種在LB 培養(yǎng)基上60℃純化培養(yǎng)，將得到的單菌落接種到裝有液體產(chǎn)孢培養(yǎng)液的試管中60℃搖床培養(yǎng)，每隔8 h 取細(xì)菌懸浮液進(jìn)行梯度稀釋活菌計(jì)數(shù)，同時(shí)孔雀綠染色并鏡檢觀察芽胞形成，血球計(jì)數(shù)板上計(jì)算芽孢的數(shù)量。

1.2.2 嗜熱脂肪芽孢桿菌懸浮液的制備

將培養(yǎng)獲得芽孢用無菌蒸餾水沖洗3 次，8 000 r·min-1離心;用無菌水進(jìn)行稀釋，梯度稀釋平板培養(yǎng)進(jìn)行芽孢濃度測(cè)定;最后用無菌水重懸，獲得0.5×107mL-1的芽孢懸浮液，備用。

1.2.3 嗜熱脂肪芽孢桿菌對(duì)不同抗生素的敏感性

分別將青霉素G、土霉素、鏈霉素和頭孢拉定等4種抗生素終濃度調(diào)至0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600，3.200，6.400，12.800，25.600 μg·mL-1，加入濾紙片，浸泡30 min;將芽孢懸浮液100 μL 均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，將浸泡好的濾紙片放置于培養(yǎng)皿的中央，60℃培養(yǎng)36 h，測(cè)量抑菌圈的直徑，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 檢測(cè)限的確定

用不含抗生素的全脂無抗乳粉稀釋液將5種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別稀釋至0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56，5.12 mg·kg-1(抗生素/乳粉)等10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3 次，確定3種檢測(cè)菌種對(duì)4種抗生素的檢測(cè)限。

1.2.5 指示劑的篩選

取96 孔板，加入300 μL 的嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢懸浮液和200 μL 不同抗生素的全脂無抗乳粉稀釋液，加入10 μL pH 指示劑溴百里酚藍(lán)或溴甲酚紫，60℃下溫育4 h，觀察顏色變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種培養(yǎng)及芽孢的制取

嗜熱脂肪芽孢桿菌是一種熱耐受性細(xì)菌，60℃下菌體可快速生長(zhǎng)［5-6］，隔夜培養(yǎng)，便可在培養(yǎng)基表面形成肉眼可見的菌落。跟蹤細(xì)菌生長(zhǎng)過程，嗜熱脂肪芽孢桿菌在24 h 時(shí)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)階段，在56 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期 (圖1)。比較發(fā)現(xiàn)，MgSO4對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)沒有明顯的影響，但能明顯誘導(dǎo)芽孢形成，使芽孢形成期提前6～7 h;在80 h 時(shí)，芽孢的比例達(dá)到97% 以上。根據(jù)嗜熱脂肪芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線和芽孢形成特點(diǎn)，初步確定了嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢制備條件為:利用添加MgSO4的液體產(chǎn)孢培養(yǎng)基，進(jìn)行200 r·min-1震蕩培養(yǎng)，80 h收集芽孢。

2.2 芽孢對(duì)抗生素敏感濃度及在乳粉中的檢測(cè)限

圖1 MgSO4對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

將收集獲得的芽孢進(jìn)行紙片法測(cè)定芽孢對(duì)青霉素G、土霉素、鏈霉素以及頭孢拉定的敏感性。從表1 中可以看出，在平板上芽孢對(duì)青霉素G、土霉素、鏈霉素和頭孢拉定的敏感度都在0.1 μg·mL-1以下，其中對(duì)頭孢拉定的敏感程度最高。在此基礎(chǔ)上，測(cè)定了嗜熱脂肪芽孢桿菌檢測(cè)乳粉的檢測(cè)限進(jìn)行了測(cè)定。由表2 可知，芽孢對(duì)這4種抗生素的檢測(cè)限均可達(dá)0.08 mg·kg-1。說明嗜熱脂肪芽孢桿菌，對(duì)這4種抗生素都具有較好的敏感性，達(dá)到了抗生素檢測(cè)的要求。

表1 嗜熱脂肪芽孢桿菌對(duì)不同抗生素的敏感濃度

表2 嗜熱脂肪芽孢桿菌檢測(cè)乳粉中抗生素檢測(cè)限

2.3 pH 指示劑的篩選及微生物顯色法測(cè)定

嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢萌發(fā)生長(zhǎng)后，培養(yǎng)液的pH 值將降低，其范圍5.2～6.8［5］。根據(jù)該pH 值范圍，選擇了溴甲酚紫 (變色范圍5.2～6.8)和溴百里酚藍(lán) (變色范圍6.0～7.6)進(jìn)行篩選。利用96 孔板進(jìn)行芽孢液、顯色液和乳粉懸浮液進(jìn)行2.5 h 的共培養(yǎng)。從表3 可知，溴甲酚紫在檢測(cè)限以下顏色變化是紫紅色變黃色，顏色區(qū)分度明顯，而溴百里酚藍(lán)的顏色從淺藍(lán)色變黃色，顏色區(qū)分度不明顯，不利于肉眼觀察。

表3 pH 指示劑的篩選

3 小結(jié)和討論

通過本實(shí)驗(yàn)研究，測(cè)定嗜熱脂肪芽孢桿菌對(duì)青霉素G、土霉素、鏈霉素以及頭孢拉定的敏感程度，確定了嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢用于檢測(cè)乳粉中抗生素的檢測(cè)限，達(dá)到了國(guó)家檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn) (TTC法)，同時(shí)篩選得到了溴甲酚紫作為顯色指示劑可以高效敏感檢測(cè)抗生素的含量。采用96 孔板進(jìn)行抗生素殘留的微生物篩選檢測(cè)，可以完成一個(gè)板上多個(gè)樣品在5 h 內(nèi)的快速檢測(cè)，比傳統(tǒng)的平板法或者HPLC 法省時(shí)省力。同時(shí)，本研究建立的微生物顯色檢測(cè)比抑菌圈更易于觀測(cè)和判別，因此有較好的檢出限。嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢具有很強(qiáng)的抗逆性，利于保留及檢測(cè)試劑盒的開發(fā)。當(dāng)前，商品化的微生物試劑盒和免疫試劑盒的價(jià)格都比較高，本研究中所建立的微生物顯色檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，具有很好的推廣應(yīng)用前景。

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