無(wú)患子總皂苷提取工藝對(duì)比

金 秋，奚立民，張昕欣，柯中爐

(臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化制藥研發(fā)中心，浙江 臺(tái)州 318000)

無(wú)患子 (Sapindus mukorossi Gaertn)，又名肥皂樹(shù)，在我國(guó)長(zhǎng)江流域和華南各省均有栽培［1］。其假種皮中含有大量皂苷成分，主要包括以常春藤皂苷元為基本骨架的三萜皂苷及一些倍半萜皂苷［2］。無(wú)患子皂苷具有較強(qiáng)去污能力［3］，易降解，對(duì)皮膚刺激性小，是洗發(fā)香波、化妝品及各種生物洗滌劑的優(yōu)良原料［4］;同時(shí)還具有抗病毒、降血壓、抗真菌、殺蟲等多種藥理作用［5-9］。

皂苷類化合物分子具有親水和疏水結(jié)構(gòu)，可用水或甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑提取。目前無(wú)患子皂苷的研究和工業(yè)生產(chǎn)均以水提法為主，但水的溶解范圍很大，造成水提物雜質(zhì)含量過(guò)高，皂苷的純度降低。魏鳳玉等［10-11］研究了水提-大孔樹(shù)脂吸附法提取，并用超濾法分離提純無(wú)患子皂苷;饒厚曾等［1，12］介紹了微波萃取法提取無(wú)患子皂苷工藝。上述研究雖提出了無(wú)患子皂苷提取的一些新方法，但也存在溶劑消耗量大、能耗高和產(chǎn)品純度低等缺點(diǎn)，不適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。本研究目的在于比較各種不同提取方法對(duì)無(wú)患子皂苷提取的效率，從易操作、低能耗和低成本等角度出發(fā)，篩選最佳提取工藝，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑與儀器

供試材料為無(wú)患子假種皮，由天臺(tái)縣滿園春農(nóng)林開(kāi)發(fā)有限公司提供。將無(wú)患子假種皮置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)于80℃烘干，并用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成80 目 (0.177 mm)粉末備用。

供試試劑甲醇、乙醇、丙酮均為分析純，乙腈為色譜純;常春藤皂苷元為標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

供試儀器為SY-1000E 多用途恒溫超聲提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，MDS-6 微波萃取儀 (上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)，R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (瑞士步琪有限公司)，DHG 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，F(xiàn)W-100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) (北京時(shí)利和科技發(fā)展有限公司)，AS-220 電子分析天平 (波蘭瑞德威公司)，DK-S26 電熱恒溫水浴鍋 (上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，安捷倫1220 高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。

1.2 無(wú)患子皂苷分析色譜條件

以0.5 mg·mL-1的常春藤皂苷元乙腈溶液為對(duì)照，采用高效液相色譜法測(cè)定無(wú)患子皂苷含量［13］。色譜條件:色譜柱Angilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30℃，流動(dòng)相CH3CN∶H2O為85∶15，流速1 mL·min-1，檢測(cè)時(shí)間30 min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

無(wú)患子皂苷的提取效率用無(wú)患子皂苷得率來(lái)衡量。計(jì)算公式為:無(wú)患子皂苷得率/%=純?cè)碥召|(zhì)量/無(wú)患子假種皮干重×100。

1.3 無(wú)患子皂苷的提取

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

不同提取方式。稱取10 g 無(wú)患子假種皮干粉末，用甲醇作為溶劑，料液比為1 ∶5，分別用回流、索氏、超聲和微波4種方式來(lái)提取無(wú)患子粉末中的無(wú)患子皂苷，提取時(shí)間為0.5 h，溫度為50℃，提取次數(shù)為1 次，用液相色譜檢測(cè)各種提取液中無(wú)患子皂苷的含量，以考察提取方式對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響。設(shè)3個(gè)重復(fù)。

不同提取因素。用10 g 無(wú)患子粉末，以回流提取方式，在不同提取溶劑 (水、甲醇、乙醇和丙酮)、提取次數(shù)(1，2，3 和4 次)、料液比(1∶1，1∶3，1∶5 和1∶8)、提取時(shí)間 (1，2，3 和4 h)和提取溫度 (40℃，50℃，60℃和70℃)條件下重復(fù)提取。試驗(yàn)除了設(shè)定某單因素水平變化外，其他提取條件分別為:提取溶劑為乙醇，提取次數(shù)為3 次，料液比為1∶5，提取時(shí)間為1 h，提取溫度為50℃。合并提取液作為樣品提取物，用液相色譜檢測(cè)各種提取液中無(wú)患子皂苷的含量，以考察以上5個(gè)因素對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用10 g 無(wú)患子粉末，以回流方式提取，對(duì)提取溶劑 (A)、提取次數(shù)(B)、料液比 (C) (m/V)、提取時(shí)間 (D)和提取溫度 (E)各因素進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn)。1-4 水平因素A 分別為水、甲醇、乙醇和丙酮;因素B 分別為1，2，3 和4 次;因素C 分別為1 ∶1，1∶3，1∶5 和1 ∶8;因素D 分別為1，2，3 和4 h;因素E 分別為40℃，50℃，60℃和70℃。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用方差分析 (ANOVA)和Tukey’s test 來(lái)檢驗(yàn)各個(gè)處理間無(wú)患子皂苷得率的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取方式對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響

回流、索氏、超聲和微波4種提取方式的無(wú)患子皂苷得率均存在顯著差異 (P ＜0.001) (圖1)。其中，超聲提取的皂苷得率最高 (14.25%)，其次是微波提取 (11.02%)，而回流提取和索氏提取的得率分別為9.72% 和8.28%。由此可知，超聲提取的效率最高，其原因可能是超聲波將強(qiáng)烈的震動(dòng)能和巨大的能量傳遞給無(wú)患子粉末和溶劑，從而破壞了無(wú)患子細(xì)胞，加強(qiáng)胞內(nèi)皂苷的釋放、擴(kuò)散和溶解，提高了浸出效率。超聲提取在較短時(shí)間(0.5 h)和較低溫度 (50℃)下就能使無(wú)患子皂苷基本提取完全，是一種潛在的工業(yè)化生產(chǎn)且經(jīng)濟(jì)高效的提取方式。其他3種方式由于限定了提取溫度、時(shí)間和次數(shù)，皂苷得率低于超聲提取。如果改變上述提取條件，回流提取的皂苷得率應(yīng)該有所增加，也不失為一種簡(jiǎn)單易行的工業(yè)化提取方式。而微波提取和索氏提取由于需要高昂的設(shè)備和較高的能耗，所以工業(yè)化應(yīng)用潛力不大。

圖1 不同提取方式對(duì)皂苷得率的影響

2.1.2 提取溶劑對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響

以水、丙酮、甲醇和乙醇為溶劑提取無(wú)患子皂苷 (圖2)，除了水和丙酮之間的皂苷得率差異不顯著以外 (P ＞0.05)，4種溶劑的無(wú)患子皂苷得率存在著顯著差異。

圖2 不同提取溶劑對(duì)皂苷得率的影響

其他條件一定時(shí)，4種溶劑中，以甲醇提取的皂苷得率最高 (13.92%)，其次為乙醇 (9.68%);以水、丙酮為提取溶劑時(shí)，皂苷得率最低。雖然甲醇的皂苷得率最高，但是甲醇提取物雜質(zhì)含量較高，易吸收空氣中的水而結(jié)塊，不利于保存;且甲醇具有毒性，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。乙醇提取皂苷得率低于甲醇，但是綜合考慮提取物純度、產(chǎn)品安全性及溶劑回收容易程度等因素，推薦以乙醇作為工業(yè)化生產(chǎn)無(wú)患子皂苷的提取溶劑。

2.1.3 提取次數(shù)對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響

由圖3 可知，除提取1 次的較其他次數(shù)間的皂苷得率差異顯著以外，其余各次提取得率間的差異不顯著。同等條件下，皂苷得率隨提取次數(shù)的增加而增大。提取次數(shù)為2～4 次時(shí)，其增幅變緩。從節(jié)能降耗的角度考慮，可選擇工業(yè)化生產(chǎn)的提取次數(shù)為3 次。

圖3 不同因素對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響

2.1.4 料液比對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響

由圖3 知，除了1∶5 和1∶8 料液比的皂苷得率差異不顯著外，其他料液比的皂苷得率間均存在顯著差異。同等條件下，提取溶劑量的增加有利于皂苷的溶出，皂苷得率也隨之增加。提取溶劑在樣品量的5～8 倍時(shí)，皂苷得率變化較小。從減少成本的角度考慮，工業(yè)化生產(chǎn)無(wú)患子皂苷的提取溶劑量以樣品量的3～5倍為宜。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響

由圖3 知，提取時(shí)間為1，2，3 和4 h 的皂苷得率間的差異均不顯著。通常，隨著提取時(shí)間的增加，原料中的組分逐漸擴(kuò)散到溶劑中，一定時(shí)間后，溶于溶劑中的組分達(dá)到一定濃度后，其溶解速度變緩，最后趨于平衡［2］。由此表明，1 h 的提取時(shí)間已能基本完全提取無(wú)患子中的皂苷成分，再增加提取時(shí)間將增加能耗。因此，在工業(yè)化生產(chǎn)無(wú)患子皂苷時(shí)，提取時(shí)間可設(shè)定為1 h。

2.1.6 提取溫度對(duì)無(wú)患子皂苷得率的影響

由圖3 可知，不同提取溫度下，除了40℃較其他提取溫度的皂苷得率間存在顯著差異外，其余提取溫度的皂苷得率差異不顯著。同等條件下，40～60℃時(shí)，無(wú)患子皂苷得率隨溫度增加而增大，升至70℃后，皂苷得率不再上升。無(wú)患子皂苷在常溫下易溶于乙醇，溫度升高有利于皂苷的溶出，但溫度過(guò)高，不但會(huì)增加能耗，還會(huì)造成部分皂苷水解，生成副產(chǎn)物，影響提取物純度及后續(xù)的利用［2］。因此，為了降低能耗，工業(yè)化生產(chǎn)無(wú)患子皂苷時(shí)，提取的溫度可設(shè)定在50℃。

2.2 正交試驗(yàn)

由表1 可知，各因素對(duì)無(wú)患子皂苷提取率的影響大小依次為A ＞B ＞E ＞C ＞D，即提取溶劑對(duì)皂苷提取率的影響最大，其次為提取次數(shù)，第三為提取溫度，第四為料液比，提取時(shí)間的影響最小。最佳提取工藝條件為A2B4C2D1E2，即提取溶劑為甲醇，提取次數(shù)為4 次，料液比為1∶3，提取時(shí)間為1 h，提取溫度為50℃。經(jīng)驗(yàn)證，該條件下無(wú)患子皂苷得率為14.66%，說(shuō)明優(yōu)化出的最佳工藝是穩(wěn)定可靠的。正交試驗(yàn)結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果也基本吻合。由方差分析可以看出，提取溶劑的均方比F大于其臨界值F0.10(3，3)=2.490，說(shuō)明對(duì)皂苷提取率有影響;而提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度的F 均小于其臨界值，對(duì)皂苷提取率的影響不顯著。這是因?yàn)槿軇┑姆N類直接影響其穿透無(wú)患子細(xì)胞的能力，進(jìn)而影響皂苷的提取率。由于提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度均在適宜范圍內(nèi)考察，故對(duì)結(jié)果影響較小。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

3 小結(jié)

超聲提取無(wú)患子皂苷的提取效率明顯高于微波提取、回流提取和索氏提取，有條件的生產(chǎn)企業(yè)可購(gòu)置超聲提取儀器用于無(wú)患子皂苷的提取。回流提取雖然提取效率不如超聲提取，但其設(shè)備投入低，操作方便，經(jīng)濟(jì)可靠，也是一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)無(wú)患子皂苷的提取方式。

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定回流提取無(wú)患子皂苷的最佳提取工藝條件為:以甲醇為提取溶劑，提取次數(shù)為4 次，料液比為1∶3，提取時(shí)間為1 h，提取溫度為50℃。在該條件下，無(wú)患子皂苷的得率為14.66%。

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