紫心甘薯總黃酮對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

葉淑雅，李向榮，邵盈盈

(1.浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州 310006;3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

肝損傷過(guò)程大多與氧化應(yīng)激和免疫有關(guān)，化學(xué)物質(zhì)、藥物、酒精等能直接或間接誘導(dǎo)肝細(xì)胞生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，干擾細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，活化細(xì)胞死亡程序等，最終以轉(zhuǎn)氨酶升高為表現(xiàn)形式造成不同程度的肝功能失常。CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型是評(píng)價(jià)肝損傷藥物療效的標(biāo)準(zhǔn)模型。CCl4是一種毒性很強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)肝細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P-450 激活，生成活潑的三氯甲基自由基(·CCl3)、氯自由基(Cl-)以及三氯甲基過(guò)氧化自由基(CCl3O2)，這些自由基攻擊肝臟細(xì)胞膜上的磷脂分子，再與膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，影響蛋白質(zhì)代謝，并且破壞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，胞漿鈣離子濃度升高，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞胞漿中的可溶性酶滲出，引起一系列血液生化指標(biāo)的改變。

紫心甘薯系旋花科藤蔓性多年生草本植物甘薯(Ipomoera batatas)的干燥塊莖，是甘薯的一個(gè)新品種。紫心甘薯不同于一般的甘薯品種，它含有大量的黃酮類化合物［1］，紫心甘薯含有的黃酮類化合物穩(wěn)定性高，對(duì)熱、光、酸比較穩(wěn)定［2-3］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明，紫心甘薯總黃酮提取物具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病、調(diào)節(jié)血糖、抑菌等多種藥理作用［4-12］，但紫心甘薯總黃酮對(duì)肝臟損傷的保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究紫心甘薯總黃酮提取物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的影響，探討其保護(hù)肝臟的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用紫心甘薯提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康ICR 小鼠60 只，雌雄各半，體重18～20 g，清潔級(jí)，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(浙)2008-0033;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，保持動(dòng)物房溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(60±5)%，燈光控制12 h 晝夜交替，自由攝食和飲水。

1.2 儀器與試劑 儀器:XS105 型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司);DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);KQ-700DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Allegra 64R(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)有限公司);Tissue LyserⅡ-Qiegn 型勻漿機(jī)(RETSCH產(chǎn)品);XW80A 漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);TECAN 型酶標(biāo)分析儀(SUNRIS 產(chǎn)品)。

試劑:谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、考馬斯亮蘭總蛋白定量測(cè)試盒等均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;聯(lián)苯雙酯滴丸(BPD)購(gòu)自北京協(xié)和藥廠(批號(hào):10070104);其它試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 紫心甘薯總黃酮提取物的制備 紫心甘薯烘干粉碎后，將粉末置于燒杯中，用20 倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇在60℃下超聲提取35 min，固定超聲電功率為560 W，超聲頻率為40 kHz，經(jīng)超聲提取后，抽濾，棄去固體殘?jiān)?，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，揮干乙醇，濃縮備用，總黃酮含量為50 mg·ml-1。

2.2 動(dòng)物分組及處理 ICR 小鼠60 只，動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，按體重隨機(jī)分為6組，每組10 只，分為:空白組(正常組)、CCl4模型組、紫心甘薯總黃酮組(高、中、低劑量分別為400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1)和陽(yáng)性對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯150 mg·kg-1)。正常組與模型組給予等量體積的生理鹽水灌胃，灌胃10 d。于末次給藥后1 h，除正常對(duì)照組腹腔注射10 ml·kg-1的花生油外，其余各組均腹腔注射體積分?jǐn)?shù)0.1%CCl4花生油溶液10 ml·kg-1，禁食，不禁水。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) 16 h 后，摘取小鼠眼球取血約0.5 ml，置于1.5 ml 離心管中，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層血清，測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶。頸椎脫臼法處死小鼠，分別取肝臟和脾臟，用4℃生理鹽水漂洗，濾紙吸干血水，稱重，計(jì)算肝臟、脾臟指數(shù)。觀察肝臟和脾臟的變化。取相同部位的肝組織0.2 g，放入離心管中，加預(yù)冷生理鹽水1.8 ml，將肝組織剪碎，加入鋼珠，開(kāi)啟組織研磨儀10 min，制成10 g·ml-1肝勻漿，檢測(cè)肝組織中超氧化物歧化酶和丙二醛含量。血清和肝臟中AST、ALT、LDH、SOD、MDA 的測(cè)定，均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，以one-way ANOVA 分析各組之間的差異;若具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，則采用LSD 分析后檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，肝、脾指數(shù)與血清和肝臟中各指標(biāo)的相關(guān)性采用Pearson correlation 相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 紫心甘薯總黃酮提取物對(duì)肝損傷小鼠臟器指數(shù)的結(jié)果 與空白組相比，模型組中臟器指數(shù)顯著升高，其中肝臟指數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)，脾臟指數(shù)有極顯著性差異(P＜0.01)，說(shuō)明小鼠CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型建立成功;與模型組相比，紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組中肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著降低(P＜0.05);與空白組相比，紫心甘薯總黃酮100 mg·kg-1組小鼠的肝臟指數(shù)差異顯著(P＜0.05)，紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組小鼠的脾臟指數(shù)均有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紫心甘薯總黃酮對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of PSPF on organ index in mice(，n=10)

表1 紫心甘薯總黃酮對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of PSPF on organ index in mice(，n=10)

#:與空白組比較，P＜0.05;* :與模型組比較P＜0.05;＊＊:與模型組比較，P＜0.01;＊＊:與空白組比較，P＜0.01.

3.2 紫心甘薯總黃酮提取物對(duì)肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和LDH 的結(jié)果 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明:與空白組相比，模型組小鼠血清中AST、ALT 和LDH 活性明顯升高，其中AST 水平有顯著性差異(P＜0.05)，ALT 和LDH 水平有極顯著性差異(P＜0.01)，表明損傷程度顯著，即小鼠CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型建立成功;與模型組比較，聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥物組中AST的水平有顯著性差異(P＜0.05)，ALT 和LDH的水平均有極顯著性差異(P＜0.01)，紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組中AST、ALT 的水平均有顯著性差異(P＜0.05)，LDH 的水平均有極顯著性差異(P＜0.01);與空白組相比，紫心甘薯總黃酮200 mg·kg-1組小鼠血清中的LDH 的差異顯著(P＜0.05)，紫心甘薯總黃酮100 mg·kg-1組小鼠血清中的LDH 水平有極顯著性差異(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 藥物等對(duì)小鼠血清中AST、ALT 和LDH 的影響Table 2 Effect of drugs on the level of AST，ALT and LDH in serum(，n=10)

表2 藥物等對(duì)小鼠血清中AST、ALT 和LDH 的影響Table 2 Effect of drugs on the level of AST，ALT and LDH in serum(，n=10)

#:與空白組比較，P＜0.05;* :與模型組比較，P＜0.05;＊＊:與模型組比較，P＜0.01;##:與空白組比較，P＜0.01.

3.3 紫心甘薯總黃酮提取物對(duì)肝損傷小鼠肝組織中SOD 和MDA 含量的結(jié)果 與空白組相比，模型組的SOD 含量有極顯著性降低(P＜0.01)，MDA 含量極顯著升高(P＜0.01)，表明小鼠CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型建立成功;各給藥組與模型組比較，聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥物組及紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組小鼠肝組織中SOD 的水平和MDA 的含量均有極顯著性差異(P＜0.01);與空白組相比，聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥物組及紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組小鼠肝組織中MDA 的含量均有極顯著性差異(P＜0.01)，且紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組SOD 含量和MDA 含量存在量效關(guān)系。見(jiàn)表3。

表3 藥物等對(duì)小鼠肝組織中SOD 和MDA 的影響Table 3 Effect of drugs on the activity of SOD and the content of MDA in hepatic tissue(，n=10)

表3 藥物等對(duì)小鼠肝組織中SOD 和MDA 的影響Table 3 Effect of drugs on the activity of SOD and the content of MDA in hepatic tissue(，n=10)

#:與空白組比較，P＜0.05;* :與模型組比較，P＜0.05;＊＊:與模型組比較，P＜0.01;##:與空白組比較，P＜0.01.

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用0.1% CCl4花生油溶液建立小鼠急性肝損傷模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，預(yù)先給予紫心甘薯總黃酮提取物的小鼠，經(jīng)CCl4造模后，與模型組相比肝重指數(shù)和脾重指數(shù)相對(duì)減少，血清中的AST 與ALT 活性顯著降低，且LDH的水平也呈現(xiàn)下降，提示紫心甘薯總黃酮對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷有明顯保護(hù)作用。與聯(lián)苯雙酯化學(xué)藥相比較，紫心甘薯總黃酮具有無(wú)毒副作用的優(yōu)點(diǎn)。

SOD 是細(xì)胞內(nèi)主要的防御性抗氧化酶，能夠清除自由基，并可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出給藥組小鼠肝組織勻漿中的SOD 活性高于模型組，且400 mg·kg-1組的增加程度較200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組明顯，呈現(xiàn)出正相關(guān)性，表明肝細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)，可以抵御肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激和過(guò)氧化，使肝細(xì)胞免受損傷。

MDA 是機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程中的最終產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的生物毒性，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死，其含量直接反映了組織氧化損傷的程度。實(shí)驗(yàn)中各給藥組小鼠肝組織內(nèi)MDA 含量明顯低于模型組，表明紫心甘薯總黃酮可對(duì)抗CCl4所致的肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕CCl4對(duì)肝細(xì)胞的損害。并且400 mg·kg-1組MDA 含量的降低程度較200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組明顯，呈現(xiàn)出正相關(guān)性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫心甘薯總黃酮對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除氧自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為紫心甘薯開(kāi)發(fā)成為肝損傷的輔助治療藥物提供一定的科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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