沉默HIF-1α基因表達對大鼠肝癌細胞增殖的影響*

吳裕丹， 倪嘉延， 陳耀庭， 孫宏亮， 許林鋒△

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)每年約有60萬新發(fā)病例，居惡性腫瘤發(fā)病率的第5位［1-2］。肝癌為血供豐富的實體惡性腫瘤，由于腫瘤快速生長所需的大量血液供應以及養(yǎng)分供給導致肝癌組織細胞內(nèi)長期處于相對缺氧的微環(huán)境。缺氧誘導因子(hypoxia inducible factors，HIF)家族是缺氧適應反應的中心環(huán)節(jié)，HIF-1α是HIF最重要的功能性亞基。RNA干擾能特異性地封閉一個或多個基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，減少非特異作用引起的副作用，是極富有前途的治療手段。本研究通過轉(zhuǎn)染特異性的HIF-1α siRNA于缺氧培養(yǎng)條件下的大鼠CBRH-7919肝癌細胞，通過檢測HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以及增殖相關因子p21、cyclin D1的表達變化，探討沉默HIF-1α基因表達對肝癌細胞增殖的影響，為臨床抗腫瘤的基因治療提供相關理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

大鼠CBRH-7919肝癌細胞株由中山大學北校區(qū)動物實驗中心提供。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibico;脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000購自 Invitrogen;NC膜購自Pall;HIF-1α、p21及cyclin D1抗體購自Santa Cruz;VEGF抗體購自CST;β-actin抗體購自博士德公司;TRIzol試劑購自TaKaRa;real-time RT-PCR試劑盒購自 TaKaRa;HIF-1α、VEGF及 β-actin引物用Primer 3軟件設計，由Invitrogen公司合成。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) CBRH-7919細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5%CO2、飽和濕度)連續(xù)培養(yǎng)、傳代。將生長狀態(tài)良好的肝癌細胞消化下來以(8～10)×104/L密度接種于6孔板于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5%CO2、飽和濕度)中培養(yǎng)24 h后，加入150 μmol/L CoCl2溶液，用于模擬腫瘤內(nèi)部厭氧環(huán)境。

2.2 厭氧模型的建立 CBRH-7919細胞在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5%CO2、飽和濕度)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中連續(xù)傳代，將生長狀態(tài)良好的肝癌細胞消化后，以1×105/L密度接種于6孔板培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度CoCl2溶液，按CoCl2終濃度分為 5 組:0 μmol/L(常氧組)、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L 和 300 μmol/L，處理時間分別為12和24 h。

2.3 HIF-1α siRNA載體的構(gòu)建 選擇GenBank中大鼠 HIF-1α基因編碼區(qū)序列(coding sequence，CDS)作為分析序列，采用RNAdraw分析軟件對HIF-1α序列的二級結(jié)構(gòu)進行預測，然后按照Elbashir等推薦的siRNA設計原則進行設計。利用在線設計軟件(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)，預選出3條潛在靶核苷酸序列(靶mRNA):(1)P1:5’-AGUGACUGAUUCUGGCAGCtt-3’，P2:5’-GCUGCCAGAAUCAGUCACUtt-3’;(2)P1:5 ’-GGAUGACUUUAAGCAAGAAtt-3’，P2:5’-UUCUUGCUUAAAGUCAUCCtt-3’;(3)P1:5’-GAAACUCUUCCAAGCAAUUtt-3’，P2:5’-AAUUGCUUGGAAGAGUUUCtt-3’。參照siRNA的基本設計原理選擇靶序列，針對目的基因的序列設計siRNA表達載體互補的核苷酸鏈。將siRNA溶液與LipofectamineTM2000試劑混合，形成siRNA/LipofectamineTM2000載體復合物。

2.4 細胞轉(zhuǎn)染 6孔板種植細胞(8～10)×104/L，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，細胞匯合度達到30% ～50%。將稀釋好的HIF-1α siRNA和 LipofectamineTM2000試劑混合，形成HIF-1α siRNA/LipofectamineTM2000復合物。將HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染載體加到含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中融合，然后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后換含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，20 h恢復生長后，熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白的表達以檢測轉(zhuǎn)染效率。實驗分為空白對照組(僅加入LipofectamineTM2000試劑)和轉(zhuǎn)染組(分別將HIF-1α siRNA 序列1、2、3轉(zhuǎn)染入細胞)。

2.5 Real-time RT-PCR檢測 mRNA表達水平

TRIzol法提取6孔板內(nèi)各組細胞的總RNA并定量;各樣本取2 ng～2 μg總RNA，按TaKaRa公司試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應用實時熒光定量RT-PCR檢測，β-actin作為內(nèi)參照。PCR引物:HIF-1α 正義鏈 5'-ACTGCACAGGCCACATTCAT-3'，反義鏈 5'-CGAGGCTGTGTCGACTGAGA-3';β-actin正義鏈5'-CCTAGGCACCAGGGTGTGAT-3'，反義鏈5'-TTGGTGACAATGCCGTGTTC-3'。反應體系為 20 μL，反應條件為95℃ 3 min預變性，95℃ 10 s，55℃ 30 s，39個循環(huán)，并在每個循環(huán)延伸末端點收集熒光信號，繪制擴增曲線。

2.6 Western blotting檢測 冷PBS洗滌細胞2次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收獲蛋白。將抽提蛋白用BCA法定量后，于100 V泳道進行SDSPAGE;電泳結(jié)束后，以30 mA、120 min將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜;封閉液(5%BSA/TBST)封閉60 min，加入Ⅰ抗(1∶3 000)4℃過夜，Ⅱ抗(1∶6 000)室溫下雜交120 min，TBST洗膜3次后用ECL試劑盒進行發(fā)光反應，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印跡并進行圖像分析。

2.7 MTT檢測肝癌細胞增殖 選擇對數(shù)生長期細胞，用不含EDTA的胰蛋白酶收集處理后的細胞，800×g離心10 min，沉淀采用300 μL PBS重懸，逐滴加入700 μL預冷的無水乙醇中，乙醇終濃度為70%，4℃避光固定過夜。800×g離心10 min，去上清。PBS洗2次。重懸細胞于500 μL含1×105U/L的RNase A的PBS緩沖液中，避光，37℃孵育30 min。加2 g/L PI至終濃度50 mg/L，避光孵育30 min。流式細胞儀激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm檢測。

2.8 BrdU摻入實驗檢測細胞增殖 細胞在轉(zhuǎn)染后24 h，取對數(shù)生長的細胞，用0.25%胰酶消化細胞，以完全培養(yǎng)基(含10%FBS的RPMI-1640)重懸細胞沉淀，將細胞種于無菌蓋玻片上，孵箱培養(yǎng)細胞，待其貼壁。用無血清培養(yǎng)基饑餓細胞48 h后，更換含血清培養(yǎng)基，孵育4 h。取出蓋玻片，用10 μmol/L BRDU標記細胞1 h。倒去培養(yǎng)基，PBS洗干凈。吸去固定液，PBS洗2～3次各5 min。滴加用0.1%檸檬酸三鈉緩沖液配制成的0.1%的曲拉通溶液，室溫下破膜5～10 min，以增加細胞的通透性。倒掉曲拉通溶液，PBS洗2～3次各5 min，滴加3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫10 min。倒掉過氧化氫溶液，PBS洗2～3次各5 min，滴加正常山羊血清封閉液阻斷內(nèi)源性生物素，室溫下10～30 min。甩去血清，每張切片加1滴或50 μL的Ⅰ抗，37℃孵育60 min或4℃過夜。PBS洗2～3次各5 min，甩去PBS液，每張切片加50 μLⅡ抗，室溫下孵育30～60 min。PBS洗細胞5 min×3次，Olympus BX51熒光顯微鏡拍照。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)應用SPSS 17.0版軟件分析。計量資料用均數(shù)±標準差 (mean±SD)表示，兩組間采用t檢驗，多個不同處理組組內(nèi)、組間計量資料的比較應用單因素方差分析。取雙側(cè)為檢驗標準，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 不同濃度CoCl2條件下肝癌細胞的活性

實驗組隨著CoCl2濃度的逐漸增高，CBRH-7919細胞活性趨于減小，其中CoCl2濃度為800 μmol/L時，細胞的活性最小;CoCl2濃度為100～200 μmol/L時，細胞的活性相對較高，見圖1。

2 不同濃度CoCl2對HIF-1α和VEGF表達的影響

隨著 CoCl2濃度升高，HIF-1α和 VEGF mRNA相對表達量逐漸增高，濃度為200 μmol/L時達到峰值，各組與常氧處理組相比，均有顯著差異(P＜0.05)。300 μmol/L 組，HIF-1α 和 VEGF mRNA 表達呈現(xiàn)下降趨勢。相同濃度組隨著處理的時間延長至24 h，細胞的HIF-1α mRNA相對表達量進一步增加，表達仍以200 μmol/L濃度組為最高值，隨后表達反而開始降低，見圖2。與此同時，細胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達水平也呈現(xiàn)類似的表達規(guī)律(P＜0.05)，見圖 3。

Figure 1.Effects of CoCl2on the viability of CBRH-7919 cells detected by MTT assay.Mean ± SD.n=3.圖1 MTT檢測缺氧條件下CBRH-7919細胞的活性

Figure 2.Effects of CoCl2on the mRNA expression of HIF-1α(A)and VEGF(B)in CBRH-7919 cells.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖2 不同濃度CoCl2對CBRH-7919細胞HIF-1α和VEGFmRNA表達的影響

Figure 3.The protein expression of HIF-1α (A)and VEGF(B)under different concentrations(0 ～300 μmol/L)of CoCl2.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖3 不同濃度CoCl2(0～300 μmol/L)處理后HIF-1α和VEGF蛋白表達的變化

3 HIF-1α siRNA對HIF-1α和VEGF表達的影響

未轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA表達載體的對照組HIF-1α和VEGF mRNA表達沒有顯著變化，轉(zhuǎn)染3組不同的 HIF-1α siRNA表達載體后，HIF-1α和 VEGF mRNA表達明顯減少(P＜0.05)，見圖4。同步檢測結(jié)果顯示，各轉(zhuǎn)染組HIF-1α和VEGF的蛋白表達亦受到明顯抑制(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染組與對照組HIF-1α和VEGF蛋白表達相比較明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖5。

Figure 4.Changes of mRNA expression of HIF-1α and VEGF 24 h after siRNA transfection.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖4 不同siRNA表達載體轉(zhuǎn)染細胞24 h后 HIF-1α和VEGF mRNA表達的變化

Figure 5.The protein expression of HIF-1α and VEGF 24 h after siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖5 不同的siRNA表達載體轉(zhuǎn)染細胞24 h后 HIF-1α和VEGF蛋白表達的變化

4 HIF-1α siRNA 對 HIF-1α、VEGF、p21 及 cyclin D1表達的影響

HIF-1α siRNA表達載體轉(zhuǎn)染組 HIF-1α、VEGF及cyclin D1蛋白表達較對照組顯著減少，p21蛋白表達較對照組明顯增多，轉(zhuǎn)染組與對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖6。

5 HIF-1α siRNA對肝癌細胞增殖的影響

HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染組的BrdU陽性細胞比例與對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖7。

討 論

HIF-1是由Semenza等［3］于1992年在缺氧誘導的細胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β 2個亞基組成，HIF-1α決定HIF-1的活性。HIF-1α在惡性腫瘤信號轉(zhuǎn)導通路中扮演重要的角色，是腫瘤細胞對缺氧適應反應的中心環(huán)節(jié)，與腫瘤細胞增殖、腫瘤血管新生密切相關［4-5］。

近期的研究［6］顯示HIF-1α可能在VEGF表達的信號轉(zhuǎn)導通路中起著關鍵的作用，體現(xiàn)于HIF-1α可在多個層次調(diào)節(jié)VEGF的表達，其主要作用包括增強VEGF的轉(zhuǎn)錄活性與增加VEGF mRNA穩(wěn)定性2個方面。VEGF是最早被發(fā)現(xiàn)的可被缺氧環(huán)境誘導生成并促進腫瘤新生血管生成的生長因子［7］。HIF-1α上調(diào)的VEGF表達增多不僅能夠刺激腫瘤新生血管的形成，維持腫瘤的生長，而且發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)高水平的VEGF表達，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關［8-9］。在本研究中，通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA沉默HIF-1α，同步檢測發(fā)現(xiàn)VEGF的表達亦明顯受到抑制，與上述相關結(jié)論相一致。這些結(jié)果提示，通過沉默HIF-1α基因表達，下調(diào)VEGF的表達，可對腫瘤

Figure 6.The protein expression of HIF-1α，VEGF，p21 and cyclin D1 24 h after siRNA transfection.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖6 siRNA 轉(zhuǎn)染24 h后 HIF-1α、VEGF、p21及 cyclin D1蛋白表達的變化

Figure 7.The proliferation of hepatoma cells detected by BrdU incorporation assay.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖7 BrdU摻入實驗檢測肝癌細胞的增殖變化

新生血管的生成，以及對腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的控制起到 關鍵的作用。

p21蛋白和cyclin D1蛋白是細胞周期調(diào)控的關鍵蛋白。p21基因是一種廣譜的CDK抑制基因，位于人染色體6p21.2，是細胞周期進展的負性調(diào)節(jié)因子。p21基因參與誘導細胞凋亡，其蛋白產(chǎn)物表達的增多與細胞凋亡的增多有關。p21蛋白不僅可抑制CDK的活性，而且還可通過抑制DNA聚合酶間接阻止DNA合成［10-12］。體外實驗及體內(nèi)研究均已證實p21蛋白的表達能抑制腫瘤細胞的生長。Cyclin D1參與G1/S期轉(zhuǎn)換的調(diào)控，是細胞周期重要的正性調(diào)控因子［13-14］。本研究中，特異性siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞后，HIF-1α表達明顯減少，細胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1的表達亦明顯受到抑制，p21蛋白的表達卻明顯增多。

為進一步證明siRNA沉默HIF-1α基因表達對肝癌細胞增殖的抑制作用，本研究通過BrdU嵌入試驗檢測肝癌細胞增殖情況。我們發(fā)現(xiàn)，HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染組的BrdU陽性細胞比例明顯小于未轉(zhuǎn)染siRNA的對照組，說明轉(zhuǎn)染組肝癌細胞的DNA合成量明顯少于對照組肝癌細胞。這提示，siRNA轉(zhuǎn)染組肝癌細胞的增殖活性受到明顯抑制。因此，我們認為基因表達沉默HIF-1α可明顯抑制肝癌細胞的增殖作用。

綜上所述，利用特異性siRNA沉默HIF-1α，一方面通過下調(diào)VEGF的表達可抑制腫瘤血管生成，控制腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移;另一方面，通過對p21蛋白和cyclin D1蛋白表達的影響，抑制腫瘤細胞增殖、控制腫瘤進展，為臨床上惡性腫瘤的基因治療提供有效基因靶點及可靠的理論依據(jù)。

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