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    自噬溶酶體抑制劑氯化銨促進(jìn)維生素K3誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的作用*

    2013-11-07 06:03:18于春艷劉玉和
    中國病理生理雜志 2013年7期
    關(guān)鍵詞:氯化銨溶酶體酸性

    于春艷, 劉 希, 張 鈺, 蘇 靜, 劉玉和△

    維生素K3(vitamin K3,VK3)可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡[1]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)維生素K3能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬[2]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能[3];而另外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示自噬是II型程序化細(xì)胞死亡的形式[4]。可見細(xì)胞自噬的作用復(fù)雜,VK3誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬在腫瘤治療中的作用及其機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。因此本實(shí)驗(yàn)以He-La細(xì)胞為研究對(duì)象,應(yīng)用溶酶體抑制劑氯化銨(ammonium chloride,NH4Cl)[5]觀察對(duì) VK3 處理 HeLa 細(xì)胞的溶酶體通透性、對(duì)自噬泡形成的影響,同時(shí)觀察對(duì)細(xì)胞漿pH值的影響及對(duì)VK3作用后HeLa細(xì)胞凋亡的影響,探討VK3誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過程中的作用。

    材料和方法

    1 材料

    人HeLa細(xì)胞購自中國科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)院;新生小牛血清購自 Gibco,IMDM培養(yǎng)基購自 Hy-Clone;MTT 粉末、吖啶橙(acridine orange,AO)、BCECF-AM和Hoechst 33342均購自Sigma;單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)購自 Invitrogen。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基 (10%新生牛血清,IMDM 培養(yǎng)液,pH 7.4)中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照(control)組(細(xì)胞用 IMDM 培養(yǎng));VK3(30 μmol/L)組;NH4Cl(10 mmol/L)組;VK3(30 μmol/L)+NH4Cl(10 mmol/L)組。

    2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞以1×104cells/well接種至96孔板,每孔100 μL,每組細(xì)胞6復(fù)孔,于培養(yǎng)結(jié)束前4 h,加入5 g/L的MTT 20 μL。培養(yǎng)結(jié)束后,傾去培養(yǎng)基,每孔加入DMSO 150 μL,振蕩混勻,使結(jié)晶完全溶解,用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長處測定其吸光度(absorbance,A),可間接反映活細(xì)胞數(shù)量,用以檢測細(xì)胞活性。對(duì)照組細(xì)胞生存率為100%,其余各組生存率(%)=(各濃度組A值/對(duì)照組A值)×100%。

    2.3 AO染色檢測溶酶體穩(wěn)定性 將AO加入各組細(xì)胞中,終濃度為1 μmol/L,37 ℃孵育15 min,棄去染料,用PBS洗滌3次,405 nm 激發(fā)下[6],激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

    2.4 MDC染色檢測自噬泡的形成 將各組細(xì)胞爬片用含PBS的0.05 mmol/L MDC在37℃孵育60 min,孵育后的細(xì)胞用PBS洗滌3次,用4%多聚甲醛室溫下固定10 min,用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)點(diǎn)狀染色為陽性表現(xiàn)[7]。

    2.5 BCECF-AM檢測細(xì)胞漿pH值 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞藥物處理后,胰酶消化,分別收集各組的細(xì)胞樣品,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,用無血清無酚紅培養(yǎng)基洗1次。使用pH敏感的探針BCECFAM(20 μmol/L)標(biāo)記細(xì)胞,37℃下孵育細(xì)胞20 min,F(xiàn)ACScan 488 nm激發(fā),相應(yīng)的胞內(nèi)pH值根據(jù)其熒光強(qiáng)度大小顯示于二維點(diǎn)陣圖上(X軸520 nm,Y軸640 nm),記錄520/640發(fā)射熒光,求出該比值,該比值代表堿/酸pH值的比值,此比值低,代表pH值是酸性的。R2區(qū)域代表含有酸性pH值的細(xì)胞數(shù)[8]。

    2.6 Hoechst 33342染色檢測凋亡細(xì)胞核形態(tài) 將10 mg/L Hoechst 33342加入各組細(xì)胞中,37℃孵育10 min,4% 多聚甲醛固定5~10 min后,棄去上清,用PBS洗滌,353~365 nm激發(fā)下顯示藍(lán)色熒光,激光共聚焦顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)并計(jì)算凋亡率。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 NH4Cl和VK3對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響

    MTT結(jié)果顯示,單獨(dú)應(yīng)用NH4Cl對(duì)HeLa細(xì)胞存活率沒有影響 [(96.6±4.3)%]。VK3組細(xì)胞生存率為(77.1±3.3)%,VK3與氯化銨共同作用組He-La細(xì)胞存活率為(53.5±4.1)%,低于VK3作用組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2 AO染色檢測溶酶體通透性

    AO染色共聚焦顯微鏡觀察顯示,在VK3聯(lián)合NH4Cl處理的HeLa細(xì)胞中紅色熒光減弱,綠色熒光增強(qiáng),而單獨(dú)應(yīng)用VK3或NH4Cl處理細(xì)胞AO染色沒有改變,見圖1。

    3 MDC檢測自噬泡的變化

    MDC染色激光共聚顯微鏡觀察顯示,與對(duì)照組相比,在單獨(dú)應(yīng)用VK3作用12 h后細(xì)胞內(nèi)綠色點(diǎn)狀熒光亮度明顯增強(qiáng),提示VK3組細(xì)胞自吞噬泡產(chǎn)生明顯增多。聯(lián)合應(yīng)用 VK3和NH4Cl與單獨(dú)應(yīng)用VK3相比,細(xì)胞內(nèi)綠色點(diǎn)狀熒光亮度增強(qiáng)更明顯,提示自噬泡的數(shù)量顯著增加,見圖2。

    Figure 1.Lysosomal permeabilization analysis for acridine orange staining in HeLa cells(×400).圖1 AO染色激光共聚焦檢測HeLa細(xì)胞溶酶體通透性的變化

    Figure 2.Fluorescence microscopic analysis for MDC staining in HeLa cells(×400).圖2 MDC染色檢測HeLa細(xì)胞自噬泡的變化

    4 BCECF-AM檢測細(xì)胞漿酸化程度

    單獨(dú)應(yīng)用VK3作用HeLa細(xì)胞,F(xiàn)L1/FL2比值降低(P <0.05)。聯(lián)合應(yīng)用 VK3和 NH4Cl,F(xiàn)L1/FL2比值與單獨(dú)應(yīng)用VK3相比明顯降低(P<0.05),見圖3。R2區(qū)域代表含有酸性pH的細(xì)胞。單獨(dú)應(yīng)用VK3,酸性pH的細(xì)胞比例為13.6%,聯(lián)合應(yīng)用VK3和NH4Cl,酸性pH的細(xì)胞比例為43.8%,提示細(xì)胞漿呈酸性,見圖4。

    5 Hoechst 33342檢測NH4Cl和VK3對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

    經(jīng)Hoechst 33342染色之后,與單獨(dú)應(yīng)用VK3[凋亡率(10.6±3.3)%]相比,聯(lián)合應(yīng)用 VK3和NH4Cl細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮濃染,核分葉狀或月牙狀,呈典型凋亡細(xì)胞的形態(tài),凋亡率為(28.6±3.7)%,見圖5。

    討 論

    Figure 3.Changes of cytosolic pH induced by NH4Cl in HeLa cellsloaded with pH-sensitive fluorescentprobe BCECF-AM.Mean± SD.n=3.*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs VK3 group.圖3 BCECF-AM檢測HeLa細(xì)胞胞漿酸化程度的變化

    已有報(bào)道,許多抗腫瘤藥物在發(fā)揮抗腫瘤作用時(shí)產(chǎn)生了氧化應(yīng)激,而且ROS產(chǎn)生是藥物發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的必要因素[9]。某些化療藥物,例如三氧化二砷、evodiamine誘導(dǎo) U251或 HeLa細(xì)胞產(chǎn)生ROS聚積,直接作用于線粒體,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。研究發(fā)現(xiàn),ROS 能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[4]。Zhang等[11]報(bào)道H2O2能夠引起U251細(xì)胞LC3-II蛋白水平增加及自噬泡增多,用自噬早期階段特異性抑制劑3-MA抑制自噬,降低了H2O2引起的細(xì)胞凋亡。溶酶體抑制劑氯化銨能夠增加蛇毒素Crotoxin對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒性,細(xì)胞對(duì)蛇毒素更加敏感[12],MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,使用氯化銨后能夠使VK3誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低,提示VK3誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生的自噬可能減輕維生素K3誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

    Figure 4.The proportion of cells with acidic intracellular pH detected by BCECF-AM.圖4 BCECF-AM檢測細(xì)胞漿內(nèi)酸性的細(xì)胞比例

    Figure 5.Fluorescence microscopic analysis for Hoechst 33342 staining in HeLa cells treated with NH4Cl and VK3(×400).圖5 Hoechst 33342檢測NH4Cl和VK3對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

    自噬是溶酶體依賴的降解途徑,是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,其中最后一個(gè)過程是自噬體與溶酶體融合,最終降解細(xì)胞漿物質(zhì)和細(xì)胞器[13]。Kawai等[14]用 bafilomycin A1、氯喹及氯化銨分別處理饑餓條件下的CHO細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)線粒體與溶酶體沒有發(fā)生共定位,結(jié)果證明溶酶體的酸性對(duì)自噬體與溶酶體融合非常必要。研究發(fā)現(xiàn),自噬能清除神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元細(xì)胞中的蛋白聚集物及衰老的細(xì)胞中受損傷的線粒體等細(xì)胞器。饑餓[15]引起HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬或者堿性藥物temozolomide[16-17]引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí),用bafilomycin A1或羥氯喹處理后,發(fā)現(xiàn)自噬體與溶酶體融合被抑制,caspase激活、線粒體膜通透性增加,自噬體內(nèi)容物長壽命蛋白的降解也減少。在順鉑耐受的人卵巢癌細(xì)胞及HeLa細(xì)胞中,順鉑激活的自噬能有效地運(yùn)輸錯(cuò)誤折疊蛋白,使腫瘤細(xì)胞避免細(xì)胞凋亡[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn),如果不能清除細(xì)胞內(nèi)堆積的蛋白質(zhì),這些蛋白將對(duì)細(xì)胞具有毒性,可能引起凋亡[20]。AO實(shí)驗(yàn)及MDC實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,聯(lián)合應(yīng)用VK3和NH4Cl后,HeLa細(xì)胞溶酶體膜通透性增高,細(xì)胞內(nèi)自噬泡大量堆積,凋亡細(xì)胞數(shù)也增多,提示NH4Cl由于增加了溶酶體通透性,阻止自噬體與溶酶體融合,促使細(xì)胞內(nèi)堆積了大量自噬泡。自噬的完整過程被破壞,不能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

    TNF-α作用U937細(xì)胞時(shí),溶酶體組織蛋白酶D從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿,應(yīng)用溶酶體去垢劑MSDH作用于U937細(xì)胞,也發(fā)現(xiàn)溶酶體組織蛋白酶D從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿,同時(shí)細(xì)胞漿酸化[21]。H2O2[22]或抗腫瘤藥物[23]作用白血病細(xì)胞HL60,引起細(xì)胞漿酸化,進(jìn)而促凋亡蛋白Bax轉(zhuǎn)位至線粒體,caspase-3被激活,細(xì)胞色素C從線粒體釋放入細(xì)胞漿,發(fā)生細(xì)胞凋亡。BCECF-AM實(shí)驗(yàn)及Hoechst 33342實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,聯(lián)合應(yīng)用VK3和NH4Cl,F(xiàn)L1/FL2比值與單獨(dú)應(yīng)用VK3相比明顯降低,酸性細(xì)胞數(shù)比單獨(dú)應(yīng)用VK3增多,細(xì)胞漿發(fā)生酸化,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

    總之,我們的研究證明了自噬溶酶體抑制劑氯化銨干擾細(xì)胞自噬完整過程,促使對(duì)VK3誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡增多。自噬在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮了保護(hù)作用,有利于腫瘤細(xì)胞生存。聯(lián)合抑制自噬作用將有利于氧化應(yīng)激抗腫瘤治療效果。

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