丙酮酸乙酯對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織的保護作用*

歐陽穎， 蘇浩彬， 薛紅漫， 吳燕云， 方建培

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是圍產(chǎn)期常見病，是引起兒童智力落后、癲癇、共濟失調(diào)和腦性癱瘓的主要原因之一。目前針對該病的治療主要為支持、對癥治療，療效并不理想。因此，尋找更為有效的治療方法成為當前迫切需要解決的問題。

丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)去除乙酯基團后可形成丙酮酸，后者在氧供充足時氧化為乙酰輔酶A，維持三羧酸循環(huán)［1］;同時EP具有抗氧化和清除自由基的能力，可用于與氧化應激有關的疾病的治療［2-3］。但目前EP對缺氧缺血性腦損傷(hypoxicischemic brain damage，HIBD)新生大鼠保護作用的研究文獻僅1篇，該研究表明EP拮抗神經(jīng)細胞死亡，部分通過抑制炎癥因子的生成、抑制炎癥反應而發(fā)揮保護作用，其保護作用及機制尚未明確，需要進一步的研究［4］。因此，進一步明確EP的神經(jīng)保護作用及發(fā)現(xiàn)可能的作用機制是非常必要的。本研究旨在通過建立新生大鼠HIBD模型，從抗氧化功能方面探討EP對HIBD新生大鼠的神經(jīng)保護作用及可能機制，以探討HIE更為有效的治療方法。

材料和方法

1 動物

7日齡SD乳鼠165只，體重為8～14 g，雌雄不限，由中山大學動物中心提供。

2 主要試劑及儀器

EP購于Sigma;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;TUNEL試劑盒由Intergen提供。8%O2和92%N2的混合氣體、電子天平、恒溫缺氧裝置、恒溫烤箱、生物組織自動脫水機、切片機、電子顯微鏡等。

3 主要方法

3.1 動物分組以及缺氧缺血模型的建立 實驗動物隨機分為3組:假手術組(n=43)、HIBD模型組(n=61)和 HIBD+EP處理組(n=61)。參考 Rice等［5］方法制作新生大鼠HIBD模型。用乙醚麻醉7日齡新生大鼠，分離其左頸總動脈，結扎左頸總動脈兩端，然后從中間剪斷血管。每只動物休息1.5 h后，放入37℃水浴的密閉缺氧箱，箱內(nèi)持續(xù)充以8%O2和92%N2的混合氣體，氣流量2.5 L/min，持續(xù)時間為2.5 h。EP組大鼠在缺氧缺血前30 min、缺氧后24 h、48 h、72 h腹腔注射50 mg/kg EP。假手術組在麻醉后僅切開頸部皮膚，分離左頸總動脈，然后縫合切口。

3.2 HE染色 將腦組織置于4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS(pH 7.4)溶液中固定24 h，使用 Leica脫水機連續(xù)脫水17.5 h，常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片(5 μm厚)，按常規(guī)方法進行HE染色。觀察腦損傷組織特點和壞死神經(jīng)元特征。

3.3 電鏡的標本制作 乙醚麻醉大鼠后，剪開右心房，灌注4℃含100 U肝素的生理鹽水500 mL，然后換用4℃電鏡固定液，快速取出腦組織，由腦的前極向后極冠狀切片，厚2 mm。取病灶壞死邊緣區(qū)的皮層組織1 mm ×1 mm ×1 mm，浸泡于電鏡固定液中，固定24 h后送檢。

3.4 腦組織勻漿的制備 在72 h斷頭處死各組大鼠，取出左腦，取100 mg腦組織，用冰生理鹽水作為勻漿介質，按1 g∶9 mL比例在勻漿管中充分勻漿，即制成10%腦組織勻漿，在4℃條件下，轉速為3 500 r/min，離心15 min，收集上清液，檢測SOD活性和MDA含量。

3.5 黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性和化學比色法測定MDA含量 參考文獻［6-7］，按照南京建成生物化學公司試劑盒說明書提供的方法及步驟進行操作。SOD單位定義如下:每克組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率為50%時對應的SOD量為1個活性單位(U)。

3.6 腦組織含水量測定 在大鼠缺氧缺血后72 h，乙醚麻醉后剪開心房放血，在冰盤上取出腦組織，切除嗅腦和后腦，以大腦縱裂及視交叉中點為標志，分開左右腦，用電子天平稱取濕重后，置70℃干燥箱持續(xù)烤72 h，稱取干重。腦含水量(%)=(濕重－干重)/濕重×100%。

3.7 細胞凋亡檢測 缺氧缺血后72 h處死動物，在大腦左半球中間部位向后，取約3 mm厚度組織塊、固定、包埋后制成石蠟切片，按TUNEL試劑盒說明書操作。凋亡陽性細胞免疫強度判定和計數(shù):選擇大腦半球中間部位，由前向后，每5張切片(每張厚5 μm)取1張，共選取5張切片，每張切片在200倍顯微鏡下隨機觀察5個視野，胞漿及胞核呈淡或深棕黃色為TUNEL陽性的凋亡細胞，淡綠色為甲基綠復染的存活細胞，計數(shù)每個視野的凋亡細胞數(shù)并統(tǒng)計均值。

3.8 腦萎縮程度的評估 缺氧缺血側(左側)大腦半球萎縮程度采用萎縮百分比評估，即右腦和左腦重量差與右腦重量之比，以百分數(shù)表示。在缺氧缺血后14 d，取腦組織，以電子天平稱得左右大腦半球濕重，計算萎縮百分比。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，左右兩側腦含水量比較采用配對t檢驗，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HIBD模型的鑒定

開始結扎左側頸總動脈時，新生大鼠無不適;缺氧30 min后，乳鼠頭部顫抖，開始出現(xiàn)紫紺，躁動不安;缺氧90 min后，乳鼠活動明顯減少，部分肢體抖動明顯;缺氧2.5 h后，乳鼠被夾尾時肢體運動為向左側旋轉;2周后死亡率為29.5%(18/61)。病理切片HE染色可見大腦皮質及紋狀體有散在的小梗死灶，局部組織疏松，神經(jīng)元減少或缺失，大量小膠質細胞浸潤、聚集;海馬區(qū)有部分神經(jīng)元死亡，細胞核固縮，結構不清，見圖1。電鏡檢查見血管周圍水腫、軸突水腫斷裂、線粒體腫脹、膠質細胞吞噬現(xiàn)象、內(nèi)皮細胞水腫等現(xiàn)象，見圖2。

Figure 1.Histological changes of rat brain cortical(A，B)and hippocampal(C，D)tissues(HE staining，×200).A，C:sham operation group;B，D:HIBD group.The arrows indicate microglial aggregation.圖1 大鼠腦皮層和海馬組織學改變

Figure 2.Ultrastructural changes observed under electron microscope(×10 000).A:a normal neuron in sham operation group;B:perivascular edema in HIBD group;C:axonal edema and fracture in HIBD group;D:mitochondrial edema in HIBD group;E:particles of glial cell phagocytosis in HIBD group;F:endothelial cell edema in HIBD group.The arrows indicate the pathological changes.圖2 電鏡觀察大鼠腦皮層組織超微結構的改變

2 腦組織勻漿SOD活性和MDA含量檢測結果

在乳鼠缺氧缺血72 h后，HIBD組SOD活性明顯減弱，EP處理組較HIBD組明顯增強。HIBD組MDA含量較假手術組明顯增多，EP處理組的MDA含量較HIBD組明顯減少，各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見表1。

表1 大鼠腦組織勻漿SOD活性和MDA含量Table 1.The SOD activity and MDA content in rat brain tissue homogenate(Mean±SD.n=11)

3 腦組織含水量測定

假手術組的左右大腦含水量無顯著差異(P＞0.05);HIBD模型組缺氧缺血側(左側)大腦出現(xiàn)顯著水腫，該側的腦含水量高于對側(P＜0.05)，也高于假手術組任何一側(P＜0.05);HIBD+EP組左右兩側大腦含水量無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

4 TUNEL染色結果

陽性細胞胞體縮小，細胞核固縮，細胞核及胞漿中較多棕色顆粒，正常細胞為淡綠色。假手術組大腦皮質和海馬區(qū)偶見少量的凋亡細胞;HIBD組損傷側大腦皮質和海馬區(qū)凋亡細胞數(shù)明顯增多;HIBD+EP組損傷側大腦皮質和海馬凋亡細胞數(shù)較HIBD組明顯減少(P＜0.05)，但仍較假手術組多(P＜0.05)，見圖3和表3。

表2 左右腦含水量Table 2.The water content of the left and right brains(%.Mean±SD.n=11)

Figure 3.TUNEL staining of rat brain cortical(A，B，C)and hippocampal(D，E，F(xiàn))tissues(×200).A，D:sham operation group;B，E:HIBD group;C，F(xiàn):HIBD+EP group.The apoptotic cells were stained brown(indicated by the arrows)，while the normal cells were green(methyl green counterstaining).圖3 大鼠腦皮層和海馬組織的TUNEL染色

表3 皮質和海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)Table 3.The numbers of apoptotic neurons in cortex and hippocampus(Mean±SD.n=11)

5 腦萎縮程度的評估

在缺氧缺血后14 d，HIBD組缺氧缺血側大腦明顯萎縮，重量較對側減輕 (P＜0.01);而HIBD+EP組左側大腦亦有萎縮，但程度低于HIBD模型組(P＜0.05)，見圖4和表4。

Figure 4.Rat brain appearance in different groups.A:sham operation group，normal brain，the left hemisphere and right hemisphere of the brain was symmetrical;B:HIBD group，the left hemisphere of the brain was obviously atrophied;C:HIBD+EP group，part of the left hemisphere of the brain was atrophied.圖4 各組大鼠大腦外觀

表4 左右腦重量及腦萎縮程度Table 4.The weight of the left and right brains and atrophy percentage(Mean±SD.n=10)

討 論

Rice等［5］使用的7日齡新生大鼠，其腦發(fā)育程度相當于37周左右剛出生的新生兒，結扎左側頸總動脈，經(jīng)過8%低氧處理2 h后，可產(chǎn)生類似于新生兒HIBD的改變，缺血敏感區(qū)(結扎側大腦皮層、紋狀體、海馬和丘腦)內(nèi)出現(xiàn)明顯的缺血性改變，然而單純?nèi)毖趸騿渭兘Y扎一側頸總動脈引起的腦缺血均不能引起腦損傷。該模型穩(wěn)定且易于制作，被廣泛應用于新生兒HIE的發(fā)病機理研究，為各種干預方法的研究提供較穩(wěn)定的模型。

EP是一種安全、穩(wěn)定且極易被細胞攝取的物質。由于其較好的脂溶性，因此可更容易地進入細胞和穿過線粒體［8］，其主要作用有:(1)保存組織ATP含量。EP作為丙酮酸前體物，可通過自發(fā)或酶解途徑去除乙酯基團后形成丙酮酸，后者作為代謝底物進入三羧酸循環(huán)提供能量。(2)抗自由基損傷。此特性與它的化學結構和細胞代謝方式有關，其α-酮酸結構能通過直接的非酶促化學反應中和過氧化物，清除自由基。EP對其它活性氧基團如一氧化氮、H2O2、OH·等的產(chǎn)生也有抑制作用，具有抗氧化和清除活性氧作用［9］。有研究顯示EP可激活核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反映元件(antioxidant response element，ARE)通路，升高血紅素加氧酶1，啟動內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)［10］。因此對多種氧化應激引起的神經(jīng)損傷有明顯保護作用。(3)EP能作用于p65，抑制NF-κB的活性而發(fā)揮抗炎的作用［11］，還能降低早期炎癥因子如TNF-α、IL-6的表達，抑制晚期炎癥因子高遷移率族盒蛋白1(high-mobility group box 1 protein，HMGB1)的合成或釋放等［12-13］。

本研究選用新生大鼠HIBD模型，共注射EP四次，觀察其保護作用。在預實驗中，我們采用25、50和100 mg/kg 3個治療劑量，發(fā)現(xiàn)50 mg/kg這一劑量能明顯能提高SOD活性，故在整個實驗中選擇50 mg/kg這一劑量。同時亦有文獻報道，應用40 mg/kg EP可較好保護全身性炎性反應所引起的器官損傷［14］，與本研究所選擇的劑量相近。HIBD組腦組織含水量在術后6 h開始升高，3 d達高峰，所以本實驗選用72 h這一時點檢測腦含水量。

SOD是機體內(nèi)自然存在的超氧自由基清除因子，是一種重要的抗氧化劑。其活力的高低反映了機體清除自由基的能力。MDA是脂質過氧化反應的終產(chǎn)物，反映脂質過氧化程度，同時也間接反映氧自由基生成的量。同時MDA的高低反映了機體受自由基攻擊的嚴重程度。本實驗結果顯示缺氧缺血性損害使腦組織SOD活性下降，MDA含量增加，表明氧自由基引起的氧化性損傷為HIE的發(fā)病機理之一，與文獻結果相符［15］。EP預處理可減輕SOD活性的下降，并減少MDA含量的增加，提示EP有較強的抗自由基作用，這可能與EP可激活Nrf2/ARE通路、升高SOD和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)等有關［10］。本研究中 EP有減少神經(jīng)元凋亡、減輕血管壁的通透性和腦組織水腫的作用，這些保護作用與其抗氧化、清除自由基和減輕生物膜的損傷有關。

綜上所述，本研究證實EP對HIBD新生大鼠腦組織具有保護作用，其機制包括抗氧化、減輕腦水腫和抑制細胞凋亡的發(fā)生。盡管目前EP的應用僅限于動物實驗，其安全性和有效性尚有待進一步證實，本研究為其應用于新生兒HIE的臨床治療提供了實驗依據(jù)。

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