納米與超細二氧化鈦和氧化鋅顆粒致突變性的比較研究

王 艷 李小林 蔣 靜 邱 璐

（上海出入境檢驗檢疫局 上海 200135）

1 前言

近年來，納米技術(shù)快速發(fā)展，已經(jīng)在食品、化妝品、包裝材料、環(huán)境治理等各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，納米材料也被譽為是“21世紀(jì)最有前途的材料”。 由于納米氧化鋅（ZnO）和納米二氧化鈦（TiO2）顆粒表現(xiàn)出眾多優(yōu)良的特性，已成為許多科學(xué)家研究的熱點。納米ZnO因其表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及其高吸收率等優(yōu)良特性，在磁、光、電、催化等方面具有常規(guī)ZnO所無法比擬的性能和用途[1-2]；納米TiO2俗稱納米鈦白粉，顆粒尺寸在1-100納米，也具有比表面積大、表面張力大、熔點低、磁性強、吸收紫外線能力強等特點。

納米ZnO和納米TiO2都是非常不錯的光催化劑，納米ZnO對UVA（長波320-400 nm）和UVB（中波280-320 nm）均有屏蔽作用；納米TiO2對短波區(qū)190-280 nm、中波區(qū)280-320 nm、長波區(qū)320-400 nm三個區(qū)域內(nèi)均表現(xiàn)出優(yōu)異的吸收性能。由于它們無毒、無味、對皮膚無刺激性，不分解、不變質(zhì)，熱穩(wěn)定性好，價格便宜，其本身為白色，可以簡單地加以著色，用作化妝品的防曬劑[3]。

但是，隨著納米ZnO和TiO2的廣泛應(yīng)用，人類與其接觸的機會越來越多，它們對人體健康和生態(tài)環(huán)境的潛在影響逐步受到人們的關(guān)注。2012年9月，歐洲消費者安全科學(xué)協(xié)會（SCCS）發(fā)表了一份指南文件，內(nèi)容針對化妝品中納米材料安全評估，其中提到，目前針對納米物質(zhì)的研究主要著眼于性質(zhì)和特性等方面，但是缺乏針對納米物質(zhì)特殊的安全性評價方法，這恐怕是目前國際范圍亟待解決的問題。SCCS同時也發(fā)布了這樣的評價結(jié)論：基于目前的數(shù)據(jù)，防曬化妝品中，低于25%含量以下的非納米級ZnO，經(jīng)皮涂敷以后不會造成不良反應(yīng)。然而非納米級ZnO經(jīng)口或經(jīng)吸入后不會造成不良反應(yīng)的最高含量，目前仍未有更多的實驗結(jié)果以支撐，其安全范圍（MoS）尚不確定。指南中還指出，ZnO目前還作為著色劑應(yīng)用于化妝品中?；诩{米和微粒ZnO具有相似的毒理學(xué)特性，可以認(rèn)為ZnO作為化妝品中的著色劑經(jīng)皮涂敷是安全的，然而經(jīng)口或者經(jīng)吸入的安全性還未知，其MoS尚不明確。

由于物質(zhì)達到納米級時不但理化特性會發(fā)生改變，其生物學(xué)效應(yīng)也可能發(fā)生改變。如有研究報道，當(dāng)粒徑達到納米級時，一些原本無毒或者低毒的材料其毒性可能明顯增強[4]。但目前關(guān)于納米光化學(xué)催化材料的致突變性和安全性的研究報道仍很少，為此本研究采用Ames試驗方法對納米和超細ZnO和TiO2細顆粒的致突變性進行研究，比較TiO2和ZnO不同粒徑下致突變性的差異。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗樣品

納米ZnO（50±10 nm，純度≥99.5%）、超細ZnO（500 nm，純度≥99.8 %）、納米TiO2（25 nm，純度≥99.0 %）、超細TiO2（500 nm，純度≥99.0 %）：均購自杭州萬景新材料有限公司。

2.1.2 試劑

陽性對照誘變劑——2-氨基芴（2-AF）、甲基甲烷磺酸酯（MMS）、生物素、四環(huán)素、輔酶II、6-磷酸葡萄糖、組氨酸：購自Sigma公司；疊氮鈉（NaN3）：國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液、氯化鉀、氯化鎂溶液、20%葡萄糖溶液、營養(yǎng)肉湯、頂層培養(yǎng)基、底層培養(yǎng)基、VB培養(yǎng)基和肝微粒體代謝活化系統(tǒng)S9溶液：由本實驗室配制。

2.1.3 試驗菌株

標(biāo)準(zhǔn)測試菌株TA 9 7、TA 9 8、TA 1 0 0和TA102：由日本Japan Health Science Foudation HSRRB 提供。這些菌株按照GB15193.4-2003的方法進行如下鑒定：①組氨酸缺陷試驗（his-）；②脂多糖屏障缺陷鑒定（rfa突變）；③對紫外線敏感性鑒定（uvrB修復(fù)缺陷型的鑒定）；④氨芐青霉素抗性試驗；⑤四環(huán)素抗性試驗；⑥自發(fā)回變數(shù)（his+）。菌株經(jīng)鑒定合格后使用。

2.2 方法

2.2.1 Ames試驗

試驗前將納米和超細ZnO和TiO2顆粒經(jīng)高壓滅菌消毒。正式試驗前用超聲清洗器進行超聲振蕩15min后用于試驗。各納米材料分別設(shè)立5個劑量組，其中納米和超細ZnO顆粒均設(shè)置每皿5、10、25、50、100 μg 5個劑量組；納米和超細TiO2設(shè)置每皿5、10、20、100、500 μg 5個劑量組。以平板摻入法進行檢驗。每個劑量組均做3個平行樣，整個試驗重復(fù)2次。具體操作如下：將含組氨酸生物素溶液的頂層培養(yǎng)基2 mL分裝于試管中，45 ℃水浴保溫，然后每支試管依次加入樣品稀釋液0.1 mL、試驗菌株肉湯培養(yǎng)物0.1 mL和S9混合液0.5 mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)動平板，使之分布均勻。待凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育，48 h計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。試驗以蒸餾水為陰性對照，以疊氮鈉、2-氨基芴和甲基磺酸甲酯為陽性對照。

2.2.2 結(jié)果判定

記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）組、溶劑對照組以及陽性誘變劑對照組的每皿回變菌落數(shù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± S）表示。以受試物的回變菌落數(shù)為溶劑對照回變菌落數(shù)的2倍或2倍以上，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系者，判定為致突變陽性。受試物經(jīng)上述4個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物對鼠傷寒沙門菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)4個試驗菌株檢測后，無論在加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。

3 結(jié)果

3.1 納米和超細TiO2顆粒對鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102誘變回復(fù)突變的影響

試驗結(jié)果見表1。表1顯示，納米和超細TiO2在加入S9和不加S9情況下對TA97、TA98、TA100、TA102的誘變回復(fù)突變數(shù)與陰性對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，不同劑量的納米和超細TiO2無劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，納米和超細TiO2對上述4個菌株無致突變性。

表1 納米和超細TiO2顆粒的回復(fù)突變菌落數(shù)（± S）

表1 納米和超細TiO2顆粒的回復(fù)突變菌落數(shù)（± S）

TA97 TA98 TA100 TA102 S9（-） S9（+） S9（-） S9（+） S9（-）S9（+）S9（-）S9（+）蒸餾水 / 106±3 112±12 33±2.6 35±5 132±5 138±10 232±14 245±15組別 劑量（μg/皿）nano- TiO2 5.0 104.7±14.0 107.0±2.6 35±4 47.3±4.5 132±6 132±3 252±7 309±10 10.0 102.3±3.5 106.7±1.5 35±5 46.0±5.3 135±12 149±3 246±4 214±6 20.0 103.0±2.0 102.7±3.2 33±3 46.3±2.3 163±20 136±15 246±4 275±32 100.0 101.7±4.7 111.0±4.0 34±4 35.3±4.5 147±8 162±14 243±7 247±48 500.0 110.0±2.0 114.7±14.6 30.3±2.08 46.7±2.1 184.7±2.1 183.7±1.5 245±1 284±14 micro-TiO2 5.0 112±4.7 123±6.1 35±4 47.3±4.5 138±21.1 147±24 265.3±37.2 276±25 10.0 100±10 123±7.5 35±5 46.0±5.3 142±11.6 166±1.73 256.3±22.1 260.3±14.5 20.0 115.7±12.5 122±16 33±3 46.3±2.3 150±6 156.7±14.6 274±27.6 256.7±9.7 100.0 111±11.5 114±5.3 34±4 35.3±4.5 152.3±17 164±6.7 279±22.7 258±37 500.0 118±2 122±6.4 31.7±3.8 46.7±2.1 155.7±2.1 172±7.2 223.7±25.1 236.3±36.2 NaN3 1 － － － － 1580.0±120. 0* － － －2-AF 20 － 1566.7±100.2* － 1306.7±120.6* － 1536±324* － －MMS 1 － － － － － － 802.7±3.8* －

3.2 納米和超細ZnO顆粒對鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102誘變回復(fù)突變的影響

試驗結(jié)果見表2。表2顯示，納米和超細ZnO顆粒在加入S9和不加S9情況下對TA97、TA98、TA100、TA102的誘變回復(fù)突變數(shù)與陰性對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異，0-100μg/皿劑量范圍內(nèi)納米和超細ZnO均沒引起上述4個菌株的回復(fù)突變數(shù)的明顯增加，未表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，在加入和不加入S9情況下，納米和超細ZnO顆粒對TA97、TA98、TA100、TA102無致突變性。

表2 納米和超細ZnO顆粒的回復(fù)突變菌落數(shù)（± S）

表2 納米和超細ZnO顆粒的回復(fù)突變菌落數(shù)（± S）

TA97 TA98 TA100 TA102 S9（-） S9（+） S9（-） S9（+） S9（-）S9（+）S9（-）S9（+）蒸餾水 / 106±3 112±12 33±2.6 35±5 132±5 138±10 232±14 245±15組別 劑量（μg/皿）nano- ZnO 5.0 114±3 108±9 35±4 37±6 132±6 132±3 252±7 309±10 10.0 116±2 115±3.6 35±5 35±2.8 135±12 149±3 240.3±2.5 245.3±2.5 25.0 115±7 118±6 33±3 32±5 163±20 136±15 240.7±5.9 245.0±2.6 50.0 123±34 123±5.3 34±4 33±3 147±8 162±14 243±7 246.3±6.0 100.0 106±7 120±4 33±4 35±2 146±8 144±6 241±1 244.0±1.7 micro-ZnO 5.0 120.7±24.0 107.0±2.6 29±3.5 28.7±5.3 132±6 132±3 252±7 309±10 10.0 102.3±3.5 106.7±1.5 32±8.2 30.3±2 135±12 149±3 240.3±2.5 245.3±2.5 25.0 103.0±2.0 102.7±3.2 28.7±3.8 30.6±6.1 163±20 136±15 240.7±5.9 245.0±2.6 50.0 101.7±4.7 111.0±4.0 30±2 32.3±6.7 147±8 162±14 243±7 246.3±6.0 100.0 101.0±3.6 114.7±4.6 30.3±2.08 32.3±6.7 184.7±2.1 183.7±1.5 241±1 244.0±1.7 NaN3 1 － － － － 1580.0±120. 0* － － －2-AF 2 － 1566.7±100.2* － 1306.7±120.6* － 1536±324* － －MMS 1 － － － － － － 802.7±3.8* －

4 討論

納米TiO2具有獨特的光催化性、優(yōu)異的顏色效應(yīng)以及紫外線屏蔽等功能，其無毒、無刺激、耐水、無異味、穩(wěn)定性好，作為紫外屏蔽劑主要應(yīng)用于防曬化妝品中。納米ZnO也是很好的光催化劑，在紫外光照射下，便能分解有機物質(zhì)，抗菌和除臭，也同樣被廣泛用于化妝品，主要用來制造防曬劑[3]。納米顆粒和納米技術(shù)在化妝品行業(yè)的應(yīng)用是一個具有潛力的發(fā)展方向，但其安全問題也令人擔(dān)憂[5]。各國政府、科學(xué)界、企業(yè)界等紛紛發(fā)表關(guān)于人造納米材料安全性的調(diào)研報告。美國國家自然基金會、美國環(huán)保局和美國安全生產(chǎn)和職業(yè)保護全國委員會已聯(lián)合投入2200萬美元，用于資助65個與“納米科技與人體健康和環(huán)境影響”的研究項目。我國也已將納米安全性列入“973”項目，對納米安全性問題進行了積極部署，國家自然科學(xué)基金委已從2004年開始，對重大項目中的一些涉及了該領(lǐng)域研究的交叉學(xué)科提供了資助。

當(dāng)物質(zhì)達到納米級后，會出現(xiàn)很多常規(guī)物質(zhì)沒有的特殊性質(zhì)，如特異的表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)等，其光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)、化學(xué)等性質(zhì)也就相應(yīng)地發(fā)生十分顯著的變化。納米物質(zhì)在生物體中的生理行為與常規(guī)尺度的物質(zhì)可能會有很大的不同，是否會導(dǎo)致特殊的有害效應(yīng)？因此原有對常規(guī)尺度物質(zhì)的安全評估體系是否適合于納米材料是人們面臨的一個重大問題。充分揭示納米物質(zhì)的特性與毒作用的關(guān)系，通過與常規(guī)尺度的比較揭示其毒作用特征，無疑有助于這一問題的回答[6-7]。

常規(guī)尺度的ZnO毒性較低，而目前已有的研究資料顯示納米ZnO有較強的細胞毒性和體內(nèi)毒性，提示納米ZnO與常規(guī)尺度ZnO相比其毒性可能有明顯差異，但納米和超細的ZnO與TiO2毒性差異的研究資料相對較少。因此，本實驗采用TA97、TA98、TA100和TA102標(biāo)準(zhǔn)菌株，從遺傳致突變性方面來評價納米和超細ZnO、納米和超細TiO2顆粒的安全性。此次實驗采用平皿摻入法對對5個級數(shù)劑量的納米和超細ZnO顆粒、納米和超細TiO2進行研究，結(jié)果顯示納米和超細ZnO顆粒、納米和超細 TiO2顆粒在S9活化和非活化兩種測試條件下，誘發(fā)TA97、TA98、TA100和TA102產(chǎn)生的回變菌落數(shù)與溶劑與陰性對照相比均無明顯增加，這表明納米和超細ZnO、納米和超細TiO2在實驗劑量范圍內(nèi)未顯示致突變作用，不具有誘變性。Yoshida等[8]研究了納米ZnO的致突變作用，其實驗結(jié)果表明在有無S9的TA98、TA100、TA1535、TA1537菌種，微米ZnO和納米ZnO都沒有致突變作用，說明納米ZnO在致突變作用方面與常規(guī)ZnO沒有區(qū)別，這與本實驗結(jié)果一致。然而，對于納米或超微TiO2以及ZnO的安全性研究尚需結(jié)合動物骨髓細胞微核試驗、小鼠精子實驗以及其他體內(nèi)、外實驗結(jié)果進行綜合判定。

5 結(jié)論

在本實驗條件下，納米和超細粒徑的TiO2和ZnO顆粒在實驗劑量范圍內(nèi)均未顯示致突變性。

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