HPLC法測定片劑中雙氫青蒿素含量的不確定度評估

朱 凱

(重慶第二師范學院生化系，重慶400067)

藥品中有效成分的定量分析是藥物質量控制的重要研究領域，其定量分析結果是否準確可靠直接決定了藥物的安全性和有效性。傳統(tǒng)上判定測量結果是否準確，主要是通過測量誤差來表示。近些年，國際標準化組織(ISO)制定了《測量不確定度表達指南》，方法能夠更客觀、準確的評價測定結果的質量，不確定度是測量的重要質量特性之一［1，2］。在分析測量中，不確定度評價正在成為一種常規(guī)要求［3］。不確定度越小，則測量方法水平越高，其測量的結果使用價值越大。測量的不確定度是定量分析結果中重要組成部分之一，可用于評估定量方法是否可靠，測量結果是否可信。雙氫青蒿素哌喹片為雙氫青蒿素和磷酸哌喹組成的復方片劑，是一種治療瘧疾的優(yōu)良藥物［4，5］。雙氫青蒿素及磷酸哌喹均為中國藥典(2010年版)收載［6］。對HPLC法測定雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素含量的不確定度構成進行分析，計算不確定度的大小，為評價HPLC法測定片劑含量的結果、提高測定質量提供科學依據(jù)和參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-2010A高效液相色譜儀(包括自動進樣器)，SPD-M10Avp二極管陣列檢測器，CLASS-VP色譜工作站;Mettler AE240電子分析天平。

雙氫青蒿素哌喹片(重慶華立控股股份有限公司，每片含雙氫青蒿素40 mg、磷酸哌喹0.32 g，批號20050403)，雙氫青蒿素對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量100.0%，批號100184-200401)，乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗。色譜柱為Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈-甲醇 -0.02 mol/L硫酸銨(50∶10∶40，稀硫酸調 pH4.8)，流速1.0 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進樣量10μL。理論板數(shù)按雙氫青蒿素α異構體峰或β異構體峰計算均不低于10 000。

(2)測定法。取雙氫青蒿素哌喹片10片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于雙氫青蒿素20 mg)，置25 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，振搖5 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，靜置30 min，作為供試品溶液;另取雙氫青蒿素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.8 mg的溶液，靜置30 min，作為對照溶液。精密量取供試品溶液與對照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以α異構體和β異構體的峰面積之和計算供試品中雙氫青蒿素的含量。

2 測量不確定度的分析

2.1 測量不確定度的構成及相對合成標準不確定度的數(shù)學表達式

根據(jù)HPLC外標法以峰面積計算含量的基本原理，雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素含量的數(shù)學表達式為:

式中，X為雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的含量(mg/片)為HPLC法的校正因子(mg/mL)，AX為供試品溶液中雙氫青蒿素的峰面積，VX為供試品溶液的體積(mL)為平均片重(g/片)，mX為供試品重(g)。

2.2 不確定度分量的評定

2.2.1 HPLC 法校正因子f的相對標準不確定度urel(f)

2.2.1.1 對照溶液濃度的相對標準不確定度urel(CS)

(1)對照品稱量的相對標準不確定度urel(mS)。主要來自天平精度的標準不確定度u1(mS)和天平稱量重復性的標準不確定度u2(mS)。

①天平精度的標準不確定度u1(mS)。從天平校準證書查得，所用量程范圍內天平的精度為0.01 mg。按矩形分布計算，取包含因子則。

②天平稱量重復性的標準不確定度u2(mS)。從天平校準證書查得，所用天平的重復性(標準偏差)為0.02 mg，則 u2(mS)=s(mS)=2 × 10-2mg。

因對照溶液含對照品20.93 mg，故對照品稱量的相對標準不確定度為:

(2)對照品純度的相對標準不確定度urel(P)。由于雙氫青蒿素對照品的純度為100.0%，即分散區(qū)間半寬a=0.05%，純度p=0.999 5±0.000 5。按矩形分布計算，取包含因子則對照品純度的相對標準不確定度為:

(3)對照溶液體積的相對標準不確定度urel(VS)。主要來自量瓶體積的標準不確定度u1(VS)、定容重復性的標準不確定度u2(VS)和溶液溫度與量瓶校正溫度不同引起的標準不確定度u3(VS)。

① 量瓶體積的標準不確定度u1(VS)。查表［2］得，A級25 mL量瓶的最大允許誤差MPE為 ±0.03 mL。按矩形分布計算，取包含因子，則 u(V)

②定容重復性的標準不確定度u2(VS)。將A級25 mL量瓶用溶液定容，精密稱定，重復操作10次，則標準偏差 s(VS)=0.01 mL，故 u2(VS)=s(VS)=0.01 mL。

③溶液溫度與量瓶校正溫度不同引起的標準不確定度u3(VS)。溶液溫度Tt=26℃，量瓶校正溫度T0=20℃，查得甲醇和玻璃的體積膨脹系數(shù)分別為α醇=1.19 ×10-3和α玻=1.5 ×10-5，故25 mL量瓶因溫度不同產(chǎn)生的體積變化［2］ΔV=(α醇-α玻)× V20×(Tt-T0)=(1.19 × 10-3-1.5 × 10-5)× 25 ×(26-20)=0.18 mL。按矩形分布計算，取包含因子，則

故對照溶液體積的相對標準不確定度為:

因此，對照溶液濃度的相對標準不確定度為:

2.2.1.2 對照溶液色譜峰面積的相對標準不確定度urel(AS)

對照溶液連續(xù)進樣10 次，測得峰面積為:251 638，250 540，249 386，251 880，252 519，251 173，248 497，250 321，251 707，250 892。計算得，均值為250 855，標準偏差 s(AS)=1 219，則 u(AS)=s(AS)=1 219。

測定校正因子f時，對照溶液平行進樣6次，測得峰面積為:253 656，253 483，251 628，251 880，252 519和251 707。故對照溶液色譜峰面積的相對標準不確定度為:

2.2.2 供試品溶液色譜峰面積的相對標準不確定度urel(AX)

供試品溶液平行進樣2次，測得峰面積為243 799和241 057，均值AX=242 428，極差R=2 742。當平行測定次數(shù) n=2時，查得［7］極差系數(shù) C=1.13，則=2.4 ×103，故供試品溶液色譜峰面積的相對標準不確定度為:

2.2.3 供試品溶液體積的相對標準不確定度urel(VX)

供試品溶液的體積為25 mL。按“2.2.1.1對照溶液體積的相對標準不確定度urel(VS)”項下計算，供試品溶液體積的相對標準不確定度為:

2.2.4 供試品稱量的相對標準不確定度urel(mX)

供試品溶液中，供試品重0.265 1 g。按“2.2.1.1對照品稱量的相對標準不確定度urel(mS)”項下計算，供試品稱量的相對標準不確定度為:

按“2.2.1.1天平精度的標準不確定度u1(mS)”項下計算=5.8 × 10-3mg。

按“2.2.1.1稱量重復性的標準不確定度u2(mS)”項下計算)=2 × 10-2mg。

根據(jù)中國藥典(2010年版)二部附錄ⅠA片劑重量差異檢查法［6］，取供試品20片，精密稱定，每片的重量分別為 0.530 3，0.530 7，0.532 8，0.526 4，0.529 7，0.530 4，0.534 1，0.527 3，0.528 3，0.531 4，0.528 0，0.527 3，0.535 9，0.529 7，0.532 4，0.534 1，0.529 9，0.531 4，0.526 3 g 和0.5264 g。計算得，平均片重0.530 1 g，標準偏差=2.7 mg，則片重差異的標準不確定度為［8］:

因此，供試品平均片重的相對標準不確定度為:

2.3 合成不確定度的評定

根據(jù)式(2)，供試品中雙氫青蒿素含量測定的相對合成標準不確定度為:

因為雙氫青蒿素含量測定結果X=40.1 mg，故合成標準不確定度為:

2.4 擴展不確定度的評定

按95%置信概率，取包含因子k=2，實驗擴展不確定度為:

3 結論

根據(jù)以上不確定度的評估計算，雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的含量測定結果可表示為X±U，即40.1 mg ± 0.8 mg。

HPLC法測定供試品中雙氫青蒿素含量的不確定度分量及其權重見表1。

表1 不確定度分量及其權重

從表1可看出，HPLC法測定雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素含量的不確定度由彼此獨立的、m和mX的不確定度分量構成。其中，供試品溶液色譜峰面積AX所引起的不確定度分量對合成不確定度影響最大。

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