經(jīng)門靜脈藥物灌注化療栓塞治療大鼠肝泡狀棘球蚴病的電鏡觀察

朱帝文， 穆 民， 任偉新， 胡漢華， 湯朝安， 溫 浩

肝泡狀棘球蚴?。ㄅ萸蝌什。┦且环N對人體危害極大的人畜共患寄生蟲病，有“蟲癌”之稱。大多數(shù)患者早期癥狀輕微，診治較晚，已有較廣泛的肝臟和鄰近臟器的浸潤，手術(shù)切除率較低，10年內(nèi)死亡率可高達(dá)80%［1］。目前，阿苯達(dá)唑被認(rèn)為是治療泡球蚴病的首選藥物。但該藥的治愈率僅為30%左右，并且療效不穩(wěn)定，個(gè)體差異大［2］。

本研究通過建立肝泡球蚴病大鼠模型，開腹門靜脈穿刺直接灌注阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體及碘化油混懸液，模擬介入治療途徑，觀察治療后大鼠的肝臟組織病理學(xué)變化，并探討其治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型復(fù)制及分組

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 種鼠為長沙爪鼠1只，體重65 g。清潔級(jí)Wistar大鼠40只，雄性38只，雌性2只，鼠齡 2～3月，體重（200± 18）g。

1.1.2 模型建立 40只Wistar大鼠用10%水合氯醛按3 ml/kg腹腔注射麻醉，用1 ml注射器經(jīng)皮肝臟穿刺肝右葉注射20%泡球蚴原頭節(jié)懸液0.2 ml，接種6個(gè)月后行超聲檢查及開腹探查。

1.1.3 動(dòng)物分組 利用隨機(jī)數(shù)字表將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對照組5只和實(shí)驗(yàn)組35只。接種6個(gè)月后，取復(fù)制成功的大鼠肝泡球蚴病模型，對照組大鼠開腹，采集標(biāo)本，行超微結(jié)構(gòu)觀察；實(shí)驗(yàn)組大鼠門靜脈穿刺緩慢注入阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體0.1 ml和超液態(tài)碘化油 0.1 ml，共 0.2 ml，分別于 4、7、10 d 后處死動(dòng)物，采集標(biāo)本。

1.2 電鏡標(biāo)本制備

手術(shù)刀切取組織標(biāo)本，固定2 h，用緩沖液漂洗5 min后依次進(jìn)行梯度脫水、浸透、包埋、聚合。在甲苯胺藍(lán)染色干燥后光鏡下觀察，對照定位后，60～80 nm超薄切片，再進(jìn)行染色，電鏡觀察，拍片。

2 結(jié)果

2.1 模型復(fù)制

40只Wistar大鼠接種6個(gè)月后，行超聲檢查示21只大鼠感染泡球蚴，19只未感染，經(jīng)開腹探查后證實(shí)超聲檢查21只陽性中有1只未感染。實(shí)際成功復(fù)制模型為20只。20只陽性大鼠中單發(fā)病灶17只，2個(gè)或多個(gè)病灶3只，病灶最大直徑為3.2 cm。將20只陽性大鼠分為對照組1只，實(shí)驗(yàn)組19只。

2.2 電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

圖1 對照組角質(zhì)層、生發(fā)層清晰，生發(fā)層微絨毛致密排列，分布均勻（×8 000）

對照組泡球蚴組織角質(zhì)層、生發(fā)層清晰，生發(fā)層微絨毛致密排列，分布均勻（圖1）。實(shí)驗(yàn)組第4天泡球蚴囊壁角質(zhì)層外側(cè)處聚集大量溶酶體，可見有巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞；囊壁內(nèi)側(cè)溶酶體數(shù)量較外側(cè)少，并觀察到髓鞘樣結(jié)構(gòu)。泡球蚴生發(fā)層、角質(zhì)層結(jié)構(gòu)未見明顯改變（圖2a）。第7天生發(fā)層微絨毛增粗變短，排列稀疏，部分闕如，角質(zhì)層結(jié)構(gòu)疏松。皮層細(xì)胞區(qū)內(nèi)細(xì)胞數(shù)量稍有減少，細(xì)胞排列較疏松。皮層細(xì)胞突起減少，其內(nèi)有少量空泡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，稍有擴(kuò)張，溶酶體數(shù)量較前減少，部分轉(zhuǎn)化為次級(jí)溶酶體，糖原顆粒較多，囊壁內(nèi)有較多脂質(zhì)體顆粒（圖2b～2d）。第10天囊壁部分皺縮，其外可見成纖維細(xì)胞和膠原纖維，呈纖維化表現(xiàn)；生發(fā)層、角質(zhì)層部分融合，或難以辨認(rèn)，微絨毛少量或闕如；皮層區(qū)變薄或消失，內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，表面微毛很難見到。皮層細(xì)胞變少，部分脫落壞死，可見凋亡小體形成。脂質(zhì)體被分解為直徑較小的顆粒，廣泛分布于囊泡內(nèi)，皮層區(qū)。有少量溶酶體、次級(jí)溶酶體及空泡形成（圖 2e）。

3 討論

肝泡球蚴病的首選治療方式為根治性手術(shù)切除，但大部分患者就診時(shí)肝內(nèi)重要血管、膽管及周圍臟器受侵，根治性切除率低［3］，且術(shù)后并發(fā)癥較多［4］。而肝移植術(shù)治療晚期肝泡球蚴病，術(shù)中根治性切除面臨很大困難，術(shù)后長期免疫抑制劑的應(yīng)用使泡球蚴病的復(fù)發(fā)和再感染率增加，治療費(fèi)用增加，難以推廣［5］。非根治性手術(shù)治療方法，如肝泡球蚴不完全切除術(shù)、經(jīng)皮穿刺液化壞死引流、肝泡球蚴經(jīng)皮肝穿刺膽管引流等，能夠改善患者癥狀，但術(shù)后存在膽瘺等并發(fā)癥，生存期并未延長［6］。對無法行根治性切除治療的晚期泡球蚴病患者，阿苯達(dá)唑仍是目前首選的治療方法［3］，但其效果不理想，主要原因是由于血液與病變區(qū)的藥物濃度差異顯著，囊液和囊壁的藥物只有血液中的十分之一到百分之一，而大劑量則使藥物毒性反應(yīng)明顯［7］。在目前尚無新的、有效的抗包蟲藥物應(yīng)用于臨床，如何提高阿苯達(dá)唑的治療效果顯得尤為重要。

圖2 實(shí)驗(yàn)組治療不同時(shí)間內(nèi)超微結(jié)構(gòu)所見

介入治療通過靶血管藥物灌注及栓塞，能夠消除口服藥物治療的缺點(diǎn)，使藥物定向或集中于肝泡球蚴組織，提高藥物在局部病變組織的濃度，從而提高阿苯達(dá)唑等藥物的治療效果。根據(jù)國內(nèi)外報(bào)道的血管造影表現(xiàn)，顯示肝動(dòng)脈是泡球蚴病灶的主要血供來源，實(shí)驗(yàn)研究表明門靜脈亦參與了部分血供［8］。 目前，經(jīng)肝動(dòng)脈介入治療已應(yīng)用于臨床［9］，單純經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞可能對泡球蚴病灶有直接的治療效果，但如門靜脈參與供血，直接動(dòng)脈內(nèi)給藥不能完全阻斷肝泡球蚴病灶的滋養(yǎng)血管，治療效果將會(huì)下降。

本研究中，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，治療后第4天泡球蚴組織基本正常，可見有巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集，以炎性改變?yōu)橹?。阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體及碘油到達(dá)病灶部位后需要通過一系列反應(yīng)，經(jīng)過一段時(shí)間才能發(fā)揮作用，引起組織與形態(tài)變化。第7天可見泡球蚴組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變性改變，生發(fā)層微絨毛稀少，角質(zhì)層結(jié)構(gòu)疏松。泡球蚴囊壁內(nèi)有較多脂質(zhì)體顆粒。第10天可見肝泡球蚴組織結(jié)構(gòu)破壞，囊泡塌陷，生發(fā)層、角質(zhì)層結(jié)構(gòu)壞死退變，原頭蚴形態(tài)、結(jié)構(gòu)紊亂，部分發(fā)生壞死。脂質(zhì)體被分解為直徑較小的顆粒，廣泛分布于囊泡內(nèi)，皮層區(qū)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，治療后肝泡球蚴組織病理學(xué)的改變是一個(gè)漸進(jìn)的過程，表明經(jīng)門靜脈注射阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體碘化油混懸液后，能夠引起泡球蚴組織退行改變，甚至死亡，從而發(fā)揮抗包蟲病作用。

張金輝等［10］報(bào)道，以 50 mg/kg 劑量，每周 3 次，連續(xù)10周，口服及腹腔注射阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體治療長沙爪鼠肝泡球蚴病，病理觀察以Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)改變?yōu)橹鳌?劉章鎖等［11］分別以 37.5、75、150 mg/kg 的不同劑量，每周3次，連續(xù)6周，口服及腹腔注射阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體治療小白鼠肝泡球蚴病，泡球蚴呈變性和壞死改變。口服和腹腔注射兩種給藥途徑間，不同給藥劑量之間變化無顯著性差異。Rodrigues等［12］，靜脈注射阿苯達(dá)唑納米粒子膠體注射液，治療6周，總劑量分別為6、12、24 mg/kg，結(jié)果表明其作用與口服6周，總劑量1 500 mg/kg的原粉等效，未見毒性反應(yīng)，且不同劑量間無明顯差異。本實(shí)驗(yàn)采用門靜脈灌注阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體碘化油混懸液，阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體劑量參照Rodrigues等［12］的實(shí)驗(yàn)研究，阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體為0.1 ml，約20 mg/kg，與0.1 ml碘化油混合成混懸液。治療后7、10 d即觀察到泡球蚴組織變性、壞死改變。與口服、腹腔注射、靜脈注射相比，從組織學(xué)上觀察，門靜脈介入途徑在較短時(shí)間內(nèi)獲得了相近的療效。其主要原因可能為：①門靜脈直接灌注阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體，可以顯著增加局部藥物濃度，同時(shí)阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體具有良好的肝臟靶向性，大部分在肝臟內(nèi)代謝，在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為阿苯達(dá)唑亞砜與阿苯達(dá)唑砜，迅速、有效的發(fā)揮殺傷泡球蚴的作用［13］，從而消除口服及靜脈給藥的局部藥物濃度低、全身不良反應(yīng)大的缺點(diǎn)，提高治療效果。②碘化油具持續(xù)化療和部分栓塞作用。治療第4、7天，在泡球蚴囊壁及囊腔內(nèi)均可見碘化油顆粒沉積。第10天仍可觀察到碘油顆粒，未被清除。碘油顆粒能夠滯留于泡球蚴病灶的可能原因?yàn)榕萸蝌式M織缺乏能夠清除碘油的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)。說明碘油能夠攜帶阿苯達(dá)唑進(jìn)入泡球蚴組織內(nèi)，緩慢釋放阿苯達(dá)唑，發(fā)揮持續(xù)化療作用。并且碘油顆粒存留于泡球蚴組織能夠阻斷營養(yǎng)供給，發(fā)揮部分栓塞作用，加速泡球蚴組織的缺血壞死和鈣化。

此外，在實(shí)驗(yàn)組中，因手術(shù)、實(shí)驗(yàn)干預(yù)及其他不可預(yù)料的意外原因，在開腹門靜脈穿刺直接灌注阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體及碘化油混懸液后，第4～7天死亡1只，第7～10天死亡2只。其主要原因可能為：①實(shí)驗(yàn)方法為開腹門靜脈穿刺進(jìn)行化療栓塞，未能進(jìn)行超選擇性動(dòng)脈栓塞，對肝功能損害較大，引起肝功能衰竭死亡。②相對于大鼠門脈血管，碘油脂質(zhì)體混懸液顆粒粒徑較大，正常肝組織清除較為困難，阻斷門靜脈血液供應(yīng)可加重肝功能損害。

總之，門靜脈灌注阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體碘油混懸液治療肝泡球蚴病療效迅速、確切。其意義在于通過門靜脈介入治療使治療期明顯縮短或獲得二期手術(shù)機(jī)會(huì)。同時(shí)可阻斷泡球蚴門靜脈分支血供，減少其通過血行擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的概率。門靜脈灌注阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)、肝動(dòng)脈與門靜脈的雙重介入化療栓塞治療有待于進(jìn)一步研究。

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