白芍總苷聯(lián)合吡美莫司治療散發(fā)型白癜風的臨床療效及相關實驗研究

葉蓉，聶李平，胡小平，黃星濤，江曉君

（北京大學深圳醫(yī)院，深圳518036）

白癜風是一種病因不明的色素脫失性皮膚病，自身免疫學說越來越受到關注。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞（T regulatory cells，Treg）水平或功能降低可能在白癜風發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1-2]，CD4+/CD8+T細胞比值的變化可反應機體免疫失調情況。我們應用白芍總苷膠囊（total glucosides of paeony，TGP）聯(lián)合吡美莫司軟膏（pimecrolimus）治療散發(fā)型白癜風患者，通過觀察治療前后患者皮損恢復情況，并檢測外周血中CD4+/CD8+T細胞比值和CD4+CD25+Treg水平的變化來評價其治療效果，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 45例散發(fā)型白癜風患者來自于我院皮膚科2010年5月—2012年10月門診患者，其中男21例，女24例，年齡18～64歲，平均34.97歲。依據(jù)病程長短分為3組，各組皮損面積差異無統(tǒng)計學意義。診斷標準符合中國中西醫(yī)結合學會皮膚性病專業(yè)委員會色素病學組修定的《白癜風臨床分型及療效標準》。所有患者均排除其他自身免疫性疾病、腫瘤及嚴重心肝腎等器質性疾病，女性排除妊娠及哺乳期者，檢測前1個月內未接受任何治療，所有患者均簽署相關知情同意書。治療中如發(fā)生不可耐受的不良反應等情況，則終止臨床試驗，該病例不納入統(tǒng)計分析。

1.2 實驗藥物 1%吡美莫司軟膏（愛寧達）購自德國PharmaNovartis公司，國藥準字H20050485，規(guī)格15 g/（支·盒）；白芍總苷膠囊（帕夫林）購自寧波立華制藥有限公司，國藥準字H20055058，規(guī)格0.3g/粒，36 粒/盒。

1.3 主要試劑和儀器 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）標記抗人CD4抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin,PE）標記抗人CD25抗體、FITC標記小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）同型對照及PE標記小鼠IgG同型對照的抗體購自美國BioLegnd公司，Simultest IMK Lymphocyte試劑盒購自美國BD公司，紅細胞裂解液購自上海瑞齊生物技術有限公司，流式細胞儀購自美國BeckMAN公司。

1.4 臨床療效判定 45例散發(fā)型白癜風患者，均給予白芍總苷膠囊1.2～1.8 g/d聯(lián)合1%吡美莫司軟膏外用，3個月后評價皮損恢復情況。痊愈：白斑全部消退，恢復正常膚色；顯效：白斑部分消退或縮小，恢復正常膚色的面積占皮損面積≥50%；好轉：白斑部分消退或縮??；無效：白斑無色素再生或擴大。有效率用痊愈和顯效例數(shù)占總例數(shù)的百分比表示。

1.5 標本采集及檢測 采集治療前后患者肘正中靜脈血5 mL，放入肝素化試管中，倒轉搖勻，6 h內檢測。小心吸取抗凝全血100 μL，分別加抗CD3-FITC、抗 CD4-PE 抗體各 10 μL，充分混勻，室溫避光孵育20 min，加入紅細胞裂解液2 mL，充分混勻，室溫避光孵育10 min，至液體透亮，1000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS液2 mL，1000 r/min離心5 min，棄上清，洗滌2次。將細胞懸浮于0.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）洗滌液中，振蕩混勻后上流式細胞儀檢測CD3+CD4+T細胞。同理用抗CD3-FITC、抗CD8-PE抗體測定CD3+CD8+T細胞，用抗CD4-FITC、抗CD25-PE抗體測定CD4+CD25+Treg。利用功能軟件得到CD4+/CD8+T細胞比值及CD4+CD25+Treg細胞水平分析。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，顯著性水平α＝0.05。

2 結果

2.1 3組散發(fā)型白癜風患者皮損恢復情況 臨床療效見表1。45例中白芍總苷膠囊劑量第1周均為1.8 g/d，分3次口服，其中12例出現(xiàn)大便次數(shù)明顯增多，第2周劑量減為1.2 g/d，分2次口服，耐受后有4例患者于第3～4周起劑量恢復為1.8 g/d，余8例維持1.2 g/d。另有4例外用吡美莫司軟膏局部出現(xiàn)紅斑，輕度刺痛，堅持治療1～2周后耐受。

表1 白芍總苷聯(lián)合吡美莫司治療散發(fā)型白癜風的臨床療效對比 例

2.2 3組散發(fā)型白癜風患者外周血T細胞變化情況 治療后3組散發(fā)型白癜風患者外周血CD4+/CD8+T細胞比值及CD4+CD25+Treg水平均分別高于各組治療前，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。病程＜6個月組患者外周血中CD4+/CD8+T細胞比值及CD4+CD25+Treg水平升高程度較另2組明顯，且差異有統(tǒng)計學意義，而病程6個月～2年組比≥2年組升高明顯，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表 3）。

表2 治療前后患者外周血T細胞變化情況

表3 白芍總苷聯(lián)合吡美莫司對患者CD4+/CD8+T細胞比值的影響

3 討論

目前白癜風治療效果欠佳，皮損易復發(fā)，需長期反復治療，因此尋找安全而有效的治療方法，一直是白癜風研究的熱點。CD4+CD25+Treg是一群具有免疫抑制及免疫無能作用的T細胞亞群，對維持機體免疫自穩(wěn)和免疫耐受有重要作用，其數(shù)量的缺乏或功能的缺陷與多種人類自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關[3]。Th17能夠誘導某些自身免疫病的發(fā)生，而CD4+CD25+Treg則發(fā)揮著保護作用[4-5]。Sujino等[6]研究表明，CD4+CD25+Treg能夠抑制Th17向Th1細胞的轉化，延緩結腸炎的進展。眾多研究表明，白癜風患者體內存在CD4+/CD8+T細胞比值和CD4+CD25+Treg水平的下降[7]。

白芍總苷膠囊已廣泛用于干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的治療，并取得較好的療效[8-9]。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可能通過誘導Treg細胞的分化，從而調節(jié)Foxp3啟動子的甲基化狀態(tài)，并激活IFN-γ和IL-2信號通路，最終抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內的自身免疫反應。白芍總苷治療白癜風效果如何，仍未見報道。

臨床觀察顯示，白芍總苷聯(lián)合吡美莫司軟膏能促進散發(fā)型白癜風患者皮損的恢復，病程越短臨床效果越明顯。本實驗還發(fā)現(xiàn)，白芍總苷能夠一定程度提高患者外周血中CD4+/CD8+T細胞比值和CD4+CD25+Treg水平，這兩者在維持機體免疫自穩(wěn)中發(fā)揮著重要作用，可能是導致患者皮損恢復的機制之一，同時對降低白癜風的皮損復發(fā)也可能起著一定作用。結果提示這種作用與病程有關，病程＜6個月者效果明顯優(yōu)于病程≥6個月者。由于白芍總苷具有養(yǎng)血柔肝等作用，可為合并肝功能不全患者提供新的選擇。

綜上所述，白芍總苷可能通過升高白癜風患者外周血中CD4+/CD8+T細胞比值和CD4+CD25+Treg水平，從而提高患者對維持機體免疫自穩(wěn)和免疫耐受的能力，進而促進皮損的愈合，且這種作用隨著病程的增加而減弱。但白芍總苷是如何調節(jié)T淋巴細胞的具體作用機制仍不清楚，可能通過誘導Treg細胞的分化而實現(xiàn)這種調節(jié)[10]，又可能通過何方式與黑素細胞相互作用等問題，仍有待進一步的探討。

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