血清蛋白質(zhì)指紋圖譜對晚期結(jié)直腸癌一線化療效果的預(yù)測作用

沈虹 袁瑛 李晶晶 房雪峰 譚純文 余捷凱 鄭樹

·論著·

血清蛋白質(zhì)指紋圖譜對晚期結(jié)直腸癌一線化療效果的預(yù)測作用

沈虹 袁瑛 李晶晶 房雪峰 譚純文 余捷凱 鄭樹

目的尋找能預(yù)測晚期結(jié)直腸癌一線化療療效的血清蛋白標(biāo)記物。方法選擇2008年8月至2010年7月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院的70例從未接受過治療的晚期結(jié)直腸癌患者，其中44例患者接受FOLFOX方案化療，26例患者接受FOLFIRI方案化療，進(jìn)行4個療程治療后使用RECIST評價標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分化療受益者(R)和化療無效者(NR)。留取化療前患者血清標(biāo)本，采用SELDI-TOF-MS和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對一線化療的療效進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)，42例患者為化療受益者，28例患者為化療無效者，分析兩組患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的差異，篩選出10個蛋白質(zhì)峰在化療受益組的表達(dá)明顯高于化療無效組；并由這10個峰構(gòu)建出結(jié)直腸癌一線化療療效的預(yù)測模型。經(jīng)交叉驗證，該模型的總準(zhǔn)確率為90.0%(63/70)。結(jié)論蛋白質(zhì)指紋圖譜模型是預(yù)測晚期結(jié)直腸癌患者一線化療方案治療效果的有效方法之一。

生物學(xué)標(biāo)記； 結(jié)直腸腫瘤； 蛋白質(zhì)陣列分析

全身化療是治療晚期結(jié)直腸癌患者最主要的手段。5-氟尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸鈣聯(lián)合奧沙利鉑(FOLFOX)或伊立替康(FOLFIRI)治療方案是兩個標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案，其有效率均約為40%，因此仍有一些患者要面對化療失敗、疾病進(jìn)展的可能。對于這兩個一線方案的選擇，目前臨床上未有明確的標(biāo)記物可用來預(yù)測療效并選擇出各自適合的患者。因此，如能找到合適的預(yù)測手段，在化療前就能將對某一種化療方案的受益人群篩選出來，進(jìn)行個體化的治療，這將有益于患者的治療及預(yù)后。

SELDI-TOF-MS作為近年來發(fā)展起來的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，能夠直接對臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)合生物信息學(xué)分析將有可能從患者血清樣本的大量蛋白質(zhì)和多肽信息中篩選出具有不同意義的潛在標(biāo)志物，并建立起具有較高診斷效力的蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測模型。本研究應(yīng)用SELDI蛋白質(zhì)芯片對晚期結(jié)直腸癌患者中經(jīng)一線化療方案治療的受益者和無效者的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行檢測，結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(artificial neural network，ANN)和支持向量機(jī)等生物信息學(xué)方法，初步建立了蛋白質(zhì)指紋圖譜晚期結(jié)直腸癌化療敏感性的預(yù)測模型，并探討了該模型在晚期結(jié)直腸癌患者經(jīng)一線化療方案治療的療效預(yù)測方面的應(yīng)用價值。

資料與方法

一、資料

收集2008年8月至2010年7月在浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受治療的70例經(jīng)病理確診為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，每例患者均可進(jìn)行確切的療效評估。所有患者均為初治或近6個月內(nèi)未行化療及其他抗腫瘤藥物治療者。其中男性37例，女性33例；年齡42～74歲，中位年齡60歲；結(jié)腸癌44例，直腸癌26例；高、中、低(包括黏液腺癌及印戒細(xì)胞癌)分化腺癌分別為16例、30例、24例；轉(zhuǎn)移器官為2處的9例,3處以上9例，其余為單器官轉(zhuǎn)移；肝轉(zhuǎn)移41例,肺轉(zhuǎn)移26例,腹膜轉(zhuǎn)移9例，腹膜后轉(zhuǎn)移2例，骨轉(zhuǎn)移3例。

化療期間不采用其他抗腫瘤治療方式，包括放療、手術(shù)、免疫治療等。經(jīng)本院倫理委員會同意，所有患者均簽署知情同意書。收集所有患者首次化療前的血清，所有血樣均于清晨空腹采集，在無抗凝劑的5 ml普通采血試管中室溫靜置1～2 h，使血液凝固析出血清，2 000 r/min離心5～10 min，冰浴上分裝血清于0.5 ml的Eppendorf管中，每管20～50 μl，-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

二、化療方案

FOLFOX或FOLFIRI方案化療4個療程。(1)FOLFOX方案：第1天靜脈滴注奧沙伯鉑85 mg/m2(體表面積)共2 h，亞葉酸鈣400 mg/m2(體表面積)共2 h；第1天靜永滴注5-FU 400 mg/m2(體表面積)共46～48 h，連續(xù)滴注2 d。(2)FOLFIRI方案：第1天靜脈滴注伊立替康180 mg/m2(體表面積)共30～90 min，亞葉酸鈣400 mg/m2(體表面積)與伊立替康180 mg/m2(體表面積)同時滴注共30～90 min;第1天靜脈滴注5-FU 400 mg/m2(體表面積)共46～48 h，連續(xù)滴注2 d。

療效評價：參照實體瘤的療效評價RECIST(response evaluation criteria in solid tumors)1.0標(biāo)準(zhǔn)分為：進(jìn)展(progressive disease,PD)、穩(wěn)定(stable disease,SD)、部分緩解(partial response,PR)和完全緩解(complete response,CR)。分別于4次化療后評價療效。臨床受益者為CR、PR或SD的患者；臨床無效者為PD的患者。

三、SELDI-TOF-MS

(一)實驗操作

血清標(biāo)本冰浴中解凍，10 000 r/min離心5 min(4 ℃)，10 μl U9血清處理液中加入血清5 μl，搖床上振蕩使充分混合(4 ℃,600 r/min，30 min)。用Binding Buffer將U9處理后的血清稀釋至200 μl用于上樣，搖床上振蕩使充分混合(4 ℃,600 r/min，2 min)。取上述經(jīng)U9處理并稀釋過的血清100 μl加到芯片上，芯片與血清充分反應(yīng)1 h(4 ℃,600 r/min搖床上振蕩)后去除樣品。反應(yīng)結(jié)束甩干芯片表面液體,依次以50 mmol/L乙酸鈉溶液(pH=4.10)清洗芯片3次,每次5 min;去離子水快速清洗2次。芯片自然干燥后點(diǎn)加100 μl SPA 2次,待干燥后行質(zhì)譜儀檢測。

(二)數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析

質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)定為激光強(qiáng)度165，檢測靈敏度7，檢測上限60 000 m/z，優(yōu)化收集數(shù)據(jù)范圍2 000 ～30 000 m/z(蛋白質(zhì)質(zhì)量和電荷比值,以下簡稱質(zhì)荷比)，信號收集位置20～80，每個樣本取120個點(diǎn)收集信號的平均值。原始數(shù)據(jù)先以Proteinchip Software 3.2軟件校正，使總離子強(qiáng)度及分子量達(dá)到均一，并過濾噪音，設(shè)置初始噪音過濾值5(信號與噪音比值，signal/noise，S/N)，設(shè)二次噪音過濾值為2，以10%為最小閾值進(jìn)行聚類。然后用t檢驗或Mann-Whitney秩和檢驗(后者用于處理偏態(tài)分布數(shù)據(jù))比較各組血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)(由Proteinchip Software 3.2自帶的Biomarker Wizard 3.1軟件完成)，尋找各組之間表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)峰。將結(jié)直腸癌患者化療前血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入ZJUCIPDAS網(wǎng)絡(luò)服務(wù)軟件。選擇受益組和無效組間差別最顯著的10個蛋白質(zhì)峰或所有P值小于0.05的蛋白質(zhì)峰數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出Youden指數(shù)最高的質(zhì)荷比峰值組合，用SVM留一法和判別分析留一法建立模型。每組分析樣本為n個，在所有樣本中隨機(jī)抽取n-1個樣本設(shè)為訓(xùn)練集用于建立模型，剩下的1個樣本作為測試集進(jìn)行交叉驗證。如此抽樣、訓(xùn)練及驗證過程重復(fù)n次，以期得到最為接近真實值的結(jié)果。最后同時輸出SVM、原始判別以及兩者交叉驗證的結(jié)果，并用時間序列分析的方法用二維散點(diǎn)圖的形式表示。

結(jié) 果

一、化療療效

70例行FOLFOX或FOLFIRI方案化療的結(jié)直腸癌患者，在4次化療后經(jīng)RECIST標(biāo)準(zhǔn)判斷療效，42例被判斷為臨床受益者，28例為臨床無效者。臨床受益者：CR 0例，PR 22例，SD 20例

二、SELDI-TOF-MS結(jié)果

1.建立晚期結(jié)直腸癌化療療效預(yù)測模型:通過對晚期結(jié)直腸癌患者中42例化療受益者與28例無效者血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比較，共檢測到蛋白質(zhì)峰100個(信號與噪聲比值，S/N=5時)，其中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)的蛋白質(zhì)峰14個。通過交叉驗證，判別分析軟件篩選出10個蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為9286 m/z、9431 m/z、9375 m/z、9298 m/z、4304 m/z，9352 m/z，9404 m/z，4606 m/z，9198 m/z，3963 m/z)組合構(gòu)建成的結(jié)直腸癌化療療效預(yù)測模型具有最高的總準(zhǔn)確率(表1)。

2.模型訓(xùn)練及交叉驗證：將這70份樣本隨機(jī)分成訓(xùn)練組和測試組，進(jìn)行交叉驗證，通過這10個蛋白峰的鑒別，42例化療受益的樣本中有39例被準(zhǔn)確預(yù)測，28化療無效的樣本中有24例被準(zhǔn)確預(yù)測。結(jié)果表明，該預(yù)測模型的靈敏度為90.7%(39/43)，特異度為88.9%(24/27)，總準(zhǔn)確率為90.0%(63/70)(表2)。

討 論

結(jié)直腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一。全身化療是晚期結(jié)直腸癌患者最主要的治療手段。氟尿嘧啶聯(lián)合亞葉酸鈣(5-FU+LV)方案是最經(jīng)典的選擇。隨著奧沙利鉑和伊立替康分別在1996年和2002年在美國上市，大量的隨機(jī)臨床試驗均報道奧沙利鉑聯(lián)合5-FU、LV方案與伊立替康聯(lián)合5-FU、LV方案在晚期結(jié)直腸癌患者的治療中有較好的效果[1-5]。美國國家綜合癌癥網(wǎng)(NCCN)臨床指南指出FOLFOX(5-FU+LV+奧沙利鉑)和FOLFIRI(5-FU+LV+伊立替康)均可作為晚期結(jié)直腸癌患者的一線化療方案。這兩個方案的臨床有效率相當(dāng)，均約為40%(CR+PR)。因此，仍有多數(shù)患者要面對化療失敗、疾病進(jìn)展的可能。而臨床上至今并未有明確的標(biāo)記物可用來預(yù)測化療療效和選擇適合的患者。因此，如能借助一些生物標(biāo)記物在最初的治療中選擇合適的化療方案，將會極大減少治療的盲目性，減少病人痛苦，提高治療的有效率，繼而獲得生存率的提高。

目前在臨床上常用的結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)記物有糖類抗原199、癌胚抗原等，其對腫瘤診斷及隨訪監(jiān)測具有較高的價值，但這些腫瘤標(biāo)記物的敏感性和特異性并不高，存在相當(dāng)比例的“假陽性”和“假陰性”，且不能用于療效預(yù)測。PET-CT檢查等影像學(xué)手段常用來評價腫瘤治療的效果，由于靈敏度低限制了其應(yīng)用于腫瘤療效的早期監(jiān)測。因此，尋找有效的無創(chuàng)檢測手段、獲得相應(yīng)的腫瘤標(biāo)記物用于指導(dǎo)臨床治療是目前關(guān)鍵所在。

SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的診斷，包括乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、消化系統(tǒng)惡性腫瘤[8]以及卵巢癌[9]等。相關(guān)研究報道中，已將SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)用于結(jié)直腸癌的鑒別診斷、術(shù)前病理分期、預(yù)后評估及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移評估等方面[10-14]。Smith等[15]使用該系統(tǒng)對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行的研究中，發(fā)現(xiàn)直腸癌患者經(jīng)新輔助治療1～2 d后血清蛋白質(zhì)譜將發(fā)生改變，可判定治療效果，敏感率為87.5%，特異性為80%。Zheng等[12]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者在術(shù)后兩周，其血清蛋白質(zhì)譜發(fā)生微小的變化，但這種變化與疾病狀態(tài)的具體關(guān)系仍舊不明。Christopher等[16]對結(jié)直腸癌手術(shù)患者術(shù)前血液進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)病期較晚的患者術(shù)前確診為癌的可能性更高。因此認(rèn)為血清蛋白圖譜能判斷預(yù)后，幫助制定輔助治療方案。但這些研究仍傾向于療效的監(jiān)測和預(yù)后評估，并沒有直接對某化療藥物療效進(jìn)行預(yù)測評估。

表1 晚期結(jié)直腸癌患者化療受益者(42例)與無效者(28例)蛋白質(zhì)峰的比較

續(xù)上

蛋白質(zhì)峰(m/z)4304935294044606919839631584．676±827．35343．3679±360．18388．40±465．05333．09±603．851602．84±2232．48702．11±441．07947．1406±506．90174．2481±244．07213．93±378．27175．56±389．99710．29±1786．30500．28±305．920．0007070．0007070．0008060．0012340．0026730．044639

表2 結(jié)直腸癌患者化療療效與預(yù)測模型的交叉驗證結(jié)果

本研究通過對經(jīng)過一線化療方案治療的晚期結(jié)直腸癌患者中受益者與無效者血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比較，篩選出10個蛋白質(zhì)峰，組合構(gòu)成結(jié)直腸癌化療療效預(yù)測模型，其總準(zhǔn)確率為90.0%(63/70)，靈敏度為90.7%(39/43)。這些蛋白質(zhì)峰在受益者血清中的表達(dá)均高于無效者。表明SELDI-TOF-MS與生物信息學(xué)分析相結(jié)合的方法，對化療療效的預(yù)測的準(zhǔn)確率、靈敏度、特異度都較高。

綜上所述，運(yùn)用SELDI-TOF-MS系統(tǒng)結(jié)合生物信息學(xué)方法，可以篩選出能預(yù)測接受化療的結(jié)直腸癌患者療效相關(guān)的標(biāo)志蛋白，建立高靈敏度和特異度的預(yù)測模型。因此，該預(yù)測模型的建立，為結(jié)直腸癌患者進(jìn)行更好地個體化治療提供了新的方法。但由于本研究樣本量較小，其結(jié)果對于臨床的應(yīng)用價值還有待于通過擴(kuò)大樣本量及隨訪觀察來進(jìn)一步的驗證。

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Researchonthebiomarkersforthepredictionofefficacyinfirst-linechemotherapyofmetastaticcolorectalcancerusingSELDI-TOF-MS

SHENHong＊，YUANYing，LIJing-jing，F(xiàn)ANGXue-feng，TANChun-wen，YUJie-kai，ZHENGShu.＊DepartmentofMedicaloncology,The2ndAffiliatedHospital,ZhejiangUniversity,Hangzhou310009,China

Correspondingauthor：YUANYing，Email：yuanying1999@zju.edu.cn

ObjectiveTo identify serum protein patterns which could predict the efficacy of first-line chemotherapy of metastatic colorectal cancer(CRC).MethodsSerum from 70 patients diagnosed as metastatic colorectal cancer before first-line chemotherapy were collected and analyzed for protein patterns using ANN analysis of SELDI-TOF-MS.Among the 70 cases,44 patients

FOLFOX regimen,while the other 26 patients received FOLFIRI regimen.After four cycles of the treatment,RECIST criteria were used to define the responders(R)and non-responders(NR).ResultsWith the method of SELDI-TOF-MS，10 protein peaks were identified to be significantly high expressed in 42 responders than in those 28 non-responders.A prediction model was constructed by the combination of these 10 peaks,which could achieve an accuracy of 90.0%(63/70)for the chemotherapy efficiency of CRC patients.ConclusionsThe prediction model combined of 10 protein peaks could be helpful for prediction of the first-line chemotherapy efficiency of metastatic CRC patients.

Biological markers； Colorectal neoplasms; Protein array analysis

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2013.02.05

310009 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(沈虹、袁瑛、李晶晶、房雪峰、譚純文) ；浙江大學(xué)腫瘤研究所 惡性腫瘤預(yù)警與干預(yù)教育部實驗室(余捷凱、鄭樹)

袁瑛，Email：yuanying1999@zju.edu.cn

2012-09-26)

(本文編輯：馬天翼)