桂枝芍藥知母湯對不同時間點大鼠急性足趾腫脹及炎癥介質(zhì)的影響*

★ 陳蘭英 劉輝 王昌芹 段萌 羅穎穎 劉榮華

(1.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心 南昌 330004)

桂枝芍藥知母湯對不同時間點大鼠急性足趾腫脹及炎癥介質(zhì)的影響*

★ 陳蘭英1，2**劉輝1王昌芹1段萌1羅穎穎1劉榮華2

(1.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心 南昌 330004)

目的：建立角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹模型，觀察桂枝芍藥知母湯對足趾腫脹的時序性影響及不同起效時間點炎癥介質(zhì)的影響。方法：在大鼠左后肢足趾皮下注射λ-角叉菜膠0.1 mL/只致炎，隨后于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h各測一次足趾容積，計算足趾腫脹度和腫脹抑制率，確定最佳起效時間范圍；同時研究桂枝芍藥知母湯在起效時間內(nèi)不同時間點對炎癥介質(zhì)的影響。結(jié)果：桂枝芍藥知母湯高(20g/kg)、中劑量(10g/kg)在1、2、3h，而低劑量組(5g/kg)在3h都能明顯降低足趾腫脹度和提高腫脹抑制率；與模型組比較，桂枝芍藥知母湯組在1h時血清中COX-2，PGE2，TNF-a以及NO均明顯降低(P﹤0.05)，在3h 時血清中IL-1β(P﹤0.01)、MPO(P﹤0.05)、TNF-a(P﹤0.01)、PGE2(P﹤0.01)的分泌顯著降低。結(jié)論：桂枝芍藥知母湯抗角叉菜膠致急性炎癥作用的有效時間范圍是1-3h，在1h主要抑制花生四烯酸的COX-2途徑，減少了PGE2、NO和TNF-a的釋放，在3小時則主要抑制IL-1β、TNF-a、PGE2及MPO等炎癥介質(zhì)的釋放，體現(xiàn)了中藥復(fù)方桂枝芍藥知母湯抗炎作用的時序變化特點。

桂枝芍藥知母湯；足趾腫脹；炎癥介質(zhì)；不同時間點

桂枝芍藥知母湯載于張仲景所著《金匱要略》卷上，謂：“諸肢節(jié)疼痛，身體尪羸，腳腫如脫，頭眩短氣，溫溫欲吐者?！爆F(xiàn)代藥理研究亦表明其具有治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、手足浮腫，消炎止痛、調(diào)節(jié)免疫的作用[1]且臨床療效顯著[2]。本文以經(jīng)典的角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足趾腫脹為模型[3]研究不同時間點桂枝芍藥知母湯的抗炎作用及對炎癥介質(zhì)的影響，為本方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)合理的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 桂枝芍藥知母湯處方藥材飲片購于江西中醫(yī)學(xué)院姚荷生研究室門診部，經(jīng)鑒定符合2010版《中華人民共和國藥典》一部相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，將藥材加入適量的冷蒸餾水浸泡0.5h，然后用武火加熱，待沸騰后再用文火煎煮40min，重復(fù)3次，合并3次水煎液，過濾，濃縮儲藏備用；吲哚美辛(indomethacin)購于廣東華南藥業(yè)集團有限公司。

1.2 實驗動物 SPF級SD大鼠40只，體重(160±15)g，雄性，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號SCXK(湘)2009-0004。

1.3 試劑 λ-角叉菜膠(λ-carrageenan)購于sigma公司，提前1d用生理鹽水配置為1%(w/v)的溶液；戊巴比妥鈉使用時配置為2%的生理鹽水溶液；大鼠髓過氧化物酶(MPO)、大鼠前列腺素E2(PGE2)、大鼠環(huán)氧化酶-2(COX-2)檢測試劑盒均購于上海西唐生物科技有限公司(進口分裝)；大鼠白介素-1β(IL-1β)、大鼠腫瘤壞死因子a(TNF-a)ELISA試劑盒購于上海依科賽生物制品有限公司；一氧化氮(NO)一步法測試盒購于南京建成。

1.4 儀器 YLS-7B足趾測定儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；Thermo Multiskan Mk3酶標(biāo)儀 (芬蘭)；t10/t18/t25 ika勻漿機(德國)；Hettich Mikro 22R冷凍離心機(德國)。

1.5 方法[3]將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，按體重隨機區(qū)組分為5組，即模型組、陽性給藥組、桂枝芍藥知母湯高劑量組、桂枝芍藥知母湯中劑量組、桂枝芍藥知母湯低劑量組。模型組灌胃給予相應(yīng)體積生理鹽水，陽性組灌胃給予9mg/kg的吲哚美辛；高劑量組灌胃給予20g/kg的桂枝芍藥知母湯水煎液， 中劑量組灌胃給予10g/kg的桂枝芍藥知母湯水煎液，低劑量組灌胃給予5g/kg的桂枝芍藥知母湯水煎液。所有大鼠在左后肢踝關(guān)節(jié)周圍做一標(biāo)記,測量每只大鼠正常足趾容積(V0)。給藥0.5h后，立刻給每只大鼠腹腔注射 2%戊巴比妥鈉 2mL/kg進行麻醉，麻醉后在大鼠左后肢足趾皮下注射λ-角叉菜膠(1%，W/V)0.1 mL/只致炎角交菜膠誘導(dǎo)足趾腫脹模型建立及。

1.5.1 腫脹程度測定及腫脹抑制率計算[4,5]致炎后，于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h各測一次足趾容積(Vt)，觀察不同時間腫脹度的變化(Vt-V0)，并按下面公式計算腫脹抑制率。

1.5.2 桂枝芍藥知母湯在檢測時間點對炎癥介質(zhì)的影響比較 根據(jù)大鼠時間-足趾腫脹程度測定結(jié)果，選取桂枝芍藥知母湯對足趾腫脹抑制率有顯著作用的時間點來檢測其對不同炎癥介質(zhì)變化的影響。各組在檢測時間點取腫脹的后足趾進行勻漿，3 000轉(zhuǎn)低溫離心，取上清于-80℃凍存?zhèn)溆?。為了保證組織勻漿內(nèi)含物活性，以上所有操作都在冰浴中完成，分別測定了腫瘤壞死因子-α(TNF-a)、白介素IL-1β(IL-1β)、一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、髓過氧化物酶(MPO)。以上各指標(biāo)測定根據(jù)所購買的試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié)果

2.1 桂枝芍藥知母湯對大鼠足趾腫脹的影響 桂枝芍藥知母湯對大鼠足趾腫脹有明顯抑制作用，且高、中劑量在1、2、3h有明顯作用；低劑量組在3h具有顯著作用，4h后桂枝芍藥知母湯對足趾腫脹無明顯影響(詳見表1)。

表1 桂枝芍藥知母湯對角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足腫脹度影響(抑制率%)±S，n=8)

2.2 桂枝芍藥知母湯在不同檢測時間點對炎癥介質(zhì)的影響比較 根據(jù)大鼠時間-足趾腫脹程度測定結(jié)果，選取桂枝芍藥知母湯對足趾腫脹抑制率有顯著作用的時間點(1h和3h)來檢測其對不同炎癥介質(zhì)變化的影響。結(jié)果顯示桂枝芍藥知母湯在不同檢測時間點對不同炎癥介質(zhì)含量影響不同。與模型組相比，在抗1h，給藥組大鼠血清中COX-2，PGE2，TNF-a以及NO均明顯降低(P﹤0.05)；而在3h 時，給藥組大鼠血清中IL-1β(P﹤0.01)、MPO(P﹤0.05)、TNF-a(P﹤0.01)、PGE2(P﹤0.01)的分泌顯著降低(詳見表2)。

表2 桂枝芍藥知母湯在不同檢測時間點對角叉菜膠所致足腫脹炎癥介質(zhì)變化的影響±S，n=8)

3 討論

當(dāng)機體組織受到化學(xué)、物理損傷、炎癥因子刺激時從兩方面產(chǎn)生致炎作用[6,7]：一方面激活細(xì)胞磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)水解細(xì)胞膜磷脂，生成花生四烯酸(arachidonic acid,AA)誘導(dǎo)COX-2的產(chǎn)生，其主要作用是把花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎仡愇镔|(zhì)(Prostaglandins,PGs)，其中PGE能夠傳張小血管，增高微血管通透性促進水腫發(fā)生，在較高濃度時顯示趨化效應(yīng)，吸引中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)移到損傷組織。另一方面[8]刺激白介素(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)等細(xì)胞因子的分泌，從而促進內(nèi)皮細(xì)胞表達粘附分子，加速白細(xì)胞與之粘附，引起急性炎癥、發(fā)熱等癥狀。髓過氧化物酶[9](myeloperoxidase，MPO)又稱為過氧化物酶，主要存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒中，MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細(xì)胞(PMN)的功能和活性狀態(tài)，反應(yīng)了炎癥的嚴(yán)重情況，MPO在局部組織內(nèi)越多則代表炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。

本實驗研究表明桂枝芍藥知母湯對角交叉膠誘導(dǎo)的足趾腫脹有明顯抑制作用，該作用主要是在不同時間通過對不同炎癥介質(zhì)的影響而實現(xiàn)的，且在1-3h與模型組比較有明顯差異，其中有最大差異的時間點即1h時則抑制了主要的炎癥發(fā)展通路即花生四烯酸的環(huán)氧化酶途徑，減少COX-2的產(chǎn)生，進而減少了前列腺素類物質(zhì)等炎癥介質(zhì)的釋放，而在3h時則抑制IL-1β、TNF-a、PGE2及MPO等炎癥介質(zhì)的釋放。體現(xiàn)了中藥復(fù)方桂枝芍藥知母湯抗炎作用的時序變化特點，可能與桂枝芍藥知母湯不同有效成分在不同時間點發(fā)揮作用有關(guān)，桂枝芍藥知母湯有效成分在體內(nèi)的變化及對不同炎癥介質(zhì)的作用有待進一步研究。

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EffectofGuizhiShaoyaoZhimuDecoctiononAcuteSwellinganditsInflammatoryMediatorsatDifferentTimePoints

CHENLan-ying1,2,LIUHui1，WANGChang-qin1,DUANMeng1,LUOYing-ying2，LIURong-hua1

1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;2.NationalPharmaceuticalEngineeringCenterforSolidPreparationinChineseHerbalMedicine,Nanchang330006,China

Objective: To study Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction on anti-inflammatory effect and inflammatory mediators release by establishing acute inflammatory model induced by λ- carrageenan. Method: After injecting λ- carrageenan 0.1 ml into each rat left hind toe subcutaneously，toe volume was measured at 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10h，then toe swelling degree and change of inflammatory mediators were determined at different time points. Results: The high and medium dose Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction could significantly reduce the swelling degree and improve the swelling inhibition rate at 1，2，3 hours，but the low dose medicine had obvious effect at 3 hour；Compared with the model group，serum COX-2, PGE2, TNF-a and NO on Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction group were obviously decreased at 1hour(P<0.05)，while serum IL-1 (P<0.01), MPO (P< 0.05), TNF-a (P<0.01), PGE2(P<0.01) decreased at 3hour. Conclusion: The therapeutic time of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction is 1-3 hours on acute inflammation induced by carrageenan. At 1 hour，it might interfere with COX-2 pathway of arachidonic acid (AA) metabolism and reduced release of NO，TNF-a，PGE2，but at 3 hour it inhibited the release of inflammatory mediators IL-1 β, TNF-a, PGE2and MPO. The result reflects the time-effect relationship characteristics of Chinese Medicine Compound Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction.

Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction(桂枝芍藥知母湯); Toe Swelling ; Inflammatory Mediators ; Different Time Points

國家自然科學(xué)基金資助課題(項目編號：81060373)。

**通訊作者：陳蘭英，女，博士，教授，研究方向：中藥藥效評價及作用機制研究，E-mail:cly2513@163.com。

R 285.5

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2013-07-06)