影響腐乳結晶物產生的因素*

代來鑫，盧紅梅，張麗平，張百發(fā)，姜曉琳

1(貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

2(貴州大學化學與化工學院，貴州 貴陽，550025)

腐乳是一種人們喜愛的調味品，不僅具有大豆所具有的營養(yǎng)價值，還因為經微生物發(fā)酵后，蛋白質分解成氨基酸和多肽，淀粉轉化為單糖和低聚糖，極易被人體吸收，使其生物利用度最大化［1］。另外，通過微生物發(fā)酵，大豆的苦腥味、含有的脹氣因子、抗營養(yǎng)因子等不良因素被克服，同時產生了多種具有香味的有機酸、醇、酯和氨基酸［2］。但腐乳在后酵期和貨架期容易出現(xiàn)多種影響產品外觀的質量問題，如腐乳白點和結晶物，不僅會在食用過程中給消費者帶來不便，同時也嚴重影響了企業(yè)的銷售和聲譽。研究人員對腐乳白點問題的研究比較深入［3－5］，而對腐乳結晶物的相關報道則較少。

袁振遠等［6］定性腐乳結晶物的成分為磷酸銨鎂和磷酸鎂的混合物。黃永濤等［7］經過研究分析確定貴陽某腐乳生產廠腐乳結晶物的主要成分為磷酸銨鎂(MgNH4PO4·6H2O)，不含磷酸鎂。通過對后酵車間中不同批次后酵青方腐乳樣品進行觀察對比，發(fā)現(xiàn)青方腐乳后酵前5 個月幾乎沒有結晶物現(xiàn)象，結晶物開始出現(xiàn)的時間段為后酵期6 ～7 個月，一般青方腐乳的后期發(fā)酵不少于6 個月［8］。本實驗分別取不同后酵時間(后酵8、9、10、13、14、15 個月，包括在工廠或商店的儲藏期)的有結晶物的青方腐乳樣品，測定其中相關成分含量，分析了不同后酵時間段有結晶物青方腐乳樣品相關成分與結晶物產生的關系，通過實驗模擬了不同影響因素對結晶物產生的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

青方腐乳，來源于貴陽某腐乳生產廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 腐乳鹵湯中氨氮、磷、鎂的分析方法

1.2.1.1 樣品處理

取每批次腐乳實驗樣品5 瓶，每瓶吸取5 mL 鹵湯共25 mL，定容到250 mL 容量瓶中，加濾紙過濾，制得樣品腐乳鹵湯10 倍稀釋液。

1.2.1.2 磷含量的測定

取制備好的腐乳鹵湯10 倍稀釋液，再稀釋10倍，即得腐乳鹵湯100 倍稀釋液，搖勻取3 mL 置于25 mL 容量瓶中依次加入2 mL 濃度為25 g/L 鉬酸銨溶液、1 mL 濃度為5 g/L 對苯二酚溶液、1 mL 濃度為200 g/L Na2SO3溶液，定容，靜置顯色30 min。以蒸餾水為空白，波長為660 nm 比色分析測定P 含量。3 組平行實驗，測定結果取平均值。

1.2.1.3 氨氮含量的測定

取腐乳鹵湯100 倍稀釋液1 mL，置于50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度后加入1 mL 濃度為500 g/L酒石酸鉀鈉溶液，搖勻，再加入納試劑1 mL 搖勻，室溫下放置10 min，波長420 nm 下，1 cm 比色皿，測定吸光度，計算氨氮含量。3 組平行實驗，測定結果取平均值。

1.2.1.4 鎂含量的測定

取10 mL 樣品腐乳鹵湯10 倍稀釋液，按絡合滴定法［9］測定其中Mg2+含量。乙二胺四乙酸二鈉標液的濃度為0.01062 mol/L。

1.2.2 腐乳( 坯體) 中氨基酸態(tài)氮、總酸、鹽含量的分析方法

1.2.2.1 樣液制備

將腐乳坯從瓶中直接取出，置于漏斗中，靜置30 min，以除去鹵湯。取約150 g 左右不含鹵湯的腐乳樣品，放入潔凈干燥的研缽中研磨成糊狀，備用。稱取約20 g 研磨好的腐乳樣品置于150 mL 燒杯中，加入60 ℃水80 mL，攪拌均勻并置于電爐上加熱，煮沸后即取下，冷卻至室溫(每隔0.5 h 攪拌1 次)，然后移入200 mL 容量瓶中，用少量水多次洗滌燒杯，洗液并入容量瓶中，加水定容，混勻，用干燥濾紙濾入250 mL 磨口瓶中備用。

1.2.2.2 測定方法［10］

(1)總酸、氨基酸態(tài)氮含量的測定

吸取10.0 mL 制備好的樣液，置于250 mL 廣口錐形瓶中，加水50 mL，開動磁力攪拌器，用NaOH(CNaOH=0.05 mol/L)滴定至pH8.2(酸度計)，記下消耗NaOH 的體積，計算總酸含量。再加入10 mL 甲醛溶液，混勻，用NaOH 繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消耗的NaOH 的體積，計算氨基酸態(tài)氮含量。同時取50 mL 蒸餾水做空白試驗。

(2)食鹽含量的測定

取制備好的樣液2.0 mL，置于250 mL 廣口錐形瓶中，加50 mL 水及1 mL 鉻酸鉀指示劑，混勻。用AgNO3標準溶液(0.100 mol/L)滴定至初顯磚紅色。同時取50 mL 蒸餾水做空白試驗。

1.2.2.3 計算方法

(1)總酸計算

式中:X1—試樣中總酸含量(以乳酸計)(g/100g);C— NaOH 標準溶液濃度(mol/L);V1—測定試樣消耗的NaOH 標準溶液體積(mL);V2—測定空白消耗的NaOH 標準溶液體積(mL);m—稱取腐乳質量(g);0.090—與1.00 mL NaOH 標準溶液［CNaOH=1.000 mol/L)相當?shù)娜樗岬馁|量(g)。

計算結果保留3 位有效數(shù)字。

(2)氨基酸態(tài)氮的計算

式中:X2—試樣中氨基態(tài)氮的含量(g/100g);C—NaOH 標準滴定溶液的濃度(mol/L);V1—測定試樣稀釋液加入甲醛后，消耗0.05 mol/L NaOH 標準溶液體積(mL);V2—試劑空白試驗加入甲醛后，消耗0.05 mol/L NaOH 標準溶液的體積(mL);m—稱取腐乳質量(g);0.014—與1 mL NaOH 標準溶液(CNaOH=1.000 mol/L)相當?shù)牡馁|量(g)。

計算結果保留2 位有效數(shù)字。

(3)食鹽計算

式中:X3—試樣中食鹽(以NaCl 計)的含量(g/100g);C—AgNO3標準溶液濃度(mol/L);V1—測定試樣消耗的AgNO3標準溶液體積(mL);V2—空白樣消耗的AgNO3標準溶液體積(mL);0.0585—與1 mL AgNO3標準溶液(CAgNO3=1.000 mol/L)相當?shù)腘aCl 的質量(g)。

計算結果保留2 位有效數(shù)字。

1.2.3 模擬研究不同因素對磷酸銨鎂結晶產生的影響

1.2.3.1 N、P、Mg 儲備液的配制

選擇MgCl2·6H2O、Na2HPO4·12H2O、NH4Cl 為反應藥劑［11－12］，設定Mg2+的基準物質濃度為0.041 118 mol/L(1 000 μg/mL)，稱取29.452 3 g Na2HPO4·12H2O 和4.398 8 g NH4Cl 溶解并定容到1 000 mL，配制成濃度為0.082 24 mol/L 的N、P 儲備液。另外稱取16.718 7 g MgCl2·6H2O 溶解并定容到1 000 mL，配制成濃度為0.082 24 mol/L 的Mg 儲備液。

1.2.3.2 pH 值對磷酸銨鎂結晶反應的影響

取5 個潔凈干燥的250 mL 三角瓶，先分別加入50 mL N、P 儲備液，分別以6 mol/L HCl 調節(jié)其pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，最后于每個三角瓶中依次加入50 mL Mg 儲備液混合，搖勻靜置24 h。離心取上清液稀釋相應倍數(shù)，測定氮、磷去除效率，探究pH對磷酸銨鎂結晶的影響。

1.2.3.3 氨氮濃度對磷酸銨鎂結晶反應的影響

取4 個潔凈干燥的250 mL 三角瓶，先分別加入50 mL N、P 儲備液，1 瓶不添加NH4Cl，另外3 瓶添加適量NH4Cl，使N∶P 摩爾比分別為1∶1、4∶l、8∶l、16∶l。然后于每個三角瓶中依次加入50 mL Mg 儲備液混合，搖勻靜置24 h。離心取上清液稀釋相應倍數(shù)，測定反應后溶液中磷的去除效率，探究氨氮濃度對磷酸銨鎂結晶的影響。

1.2.3.4 鹽含量對磷酸銨鎂結晶反應的影響

取5 個潔凈干燥的250 mL 三角瓶，分別加入50 mL N、P 儲備液，再分別添加適量NaCl，使溶液中NaCl 質量濃度為8%、10%、12%、14%、16%。最后于每個三角瓶中依次加入50 mL Mg 儲備液混合，搖勻靜置24 h 進行磷酸銨鎂結晶反應。離心取上清液稀釋相應倍數(shù)，測定反應后溶液中氨氮和磷的去除效率，探究鹽含量對磷酸銨鎂結晶的影響。

1.2.3.5 酒精含量對磷酸銨鎂結晶反應的影響

無水乙醇分別配制0、5°、10°、15°的酒液，取對應儲備液模擬磷酸銨鎂結晶反應。靜置24 h 取上清液稀釋相應倍數(shù)，測定反應后溶液中氨氮和磷的去除效率，探究酒精含量對磷酸銨鎂結晶的影響。

2 實驗結果與分析

2.1 不同后酵時間有結晶物青方腐乳相關成分差異分析

2.1.1 腐乳鹵湯中氨氮、磷、鎂含量變化

對不同后酵時間含結晶物的腐乳鹵湯中氨氮含量、磷含量、鎂含量、pH 值的測定結果如圖1 所示。

圖1 不同后酵時間腐乳樣品中氨氮濃度、磷、鎂含量及pH 值變化Fig.1 Changes of NH4+，Mg2+，PO43－ and pH in Sufu samples in different period of fermentation

從圖1 中，可以看出:

①隨著后酵時間的延長，腐乳鹵湯中氨氮濃度持續(xù)增加，后酵1 年后青方腐乳鹵湯中氨氮濃度達到9 780.5 μg/mL。

②磷含量隨著后酵時間的延長，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，鹵湯中磷含量最大值為1 198.3 μg/mL(后酵9 個月左右)，磷含量最低值為261.2 μg/mL。鎂含量呈持續(xù)降低趨勢，后酵1 年左右鹵湯中鎂含量最低(38.74 μg/mL)。同時對比磷、鎂的摩爾去除比(磷、鎂減少量與其相對原子質量的比值)，根據(jù)磷酸銨鎂(MgNH4PO4·6H2O)分子式其摩爾去除比應為1∶1，而實際測得磷、鎂摩爾去除比約為30∶7，遠高于理論值，說明腐乳鹵湯中磷的去除不只是由于生成磷酸銨鎂造成的。腐乳中含有較多Ca2+［13］，后酵過程中也可能結合PO43－生成磷酸鈣沉淀，對磷造成消耗，使其含量降低［14］。

③后酵8 個月以后，腐乳pH 值逐漸升高，在8 ～13 個月之間升高速率較小，13 ～15 個月的升高速率更大。關于腐乳pH 值升高的原因，付春等認為青方腐乳發(fā)酵徹底，氨基酸生成量多，氨基酸脫氨基產生氨溶于水成為NH3·H2O，使湯料pH 值升高［14］。

2.1.2 腐乳( 坯體) 中氨基酸態(tài)氮、總酸、鹽含量的含量變化

對不同后酵時間含結晶物的腐乳(坯體)氨基酸態(tài)氮、總酸、鹽含量的測定結果如圖2 所示。

圖2 不同后酵時間腐乳樣品中氨基酸態(tài)氮、總酸及食鹽含量變化Fig.2 Changes of NH4+，total acid and salt in Sufu samples in different period of fermentation

從圖2 中可以看出，青方腐乳中氨基酸態(tài)氮含量后酵半年后都能達到1 g/100 g 以上。總酸含量持續(xù)減少，與樣品腐乳中pH 值的變化一致。坯體中食鹽含量逐漸下降，可能是由于坯體中食鹽浸出到鹵湯中所致［15］。同時后酵8 個月時，氨基酸態(tài)氮(≥0.60)、總酸(≤1.30)、食鹽(≥6.5)都已達到行業(yè)要求(SB/T 10170 －2007)。

2.2 模擬研究不同因素對磷酸銨鎂結晶產生的影響

前期研究結果表明，不同后酵時間含結晶物的腐乳鹵湯及坯體中氨氮濃度、總酸(pH 值)差異明顯。同時生產上后酵過程中主要控制的工藝參數(shù)是酒精含量和鹽含量，不同種類腐乳中酒精含量和鹽含量差異很大。主要選取pH 值、氨氮濃度、酒精含量、鹽含量等因素為研究對象，在去離子水中模擬磷酸銨鎂反應，探究其對磷酸銨鎂結晶的影響。

2.2.1 pH 值對磷酸銨鎂結晶反應的影響

根據(jù)不同后酵時間含結晶物的腐乳鹵湯pH 值變化(見圖3)，在模擬實驗中設置pH 范圍為5.0 ～7.0。

圖3 表明，在實驗pH 值范圍內，pH 對于磷酸銨鎂生成有非常強的依存性，隨著pH 值的降低，磷和氨氮的去除率均減小，P 的去除率由30%降為5%，N的去除率由22%降為0.81%。當pH 值從6.5 降至6.0 時，氨氮和磷的去除率急劇降低，當pH5.0 時氨氮的去除率僅為0.81%。同時觀察對比模擬反應后三角瓶中結晶物生成現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)pH≤6.0 時三角瓶底部無結晶物生成，可以考慮通過用降低腐乳鹵湯中的pH 值的方法來控制腐乳結晶物的生成。此外，王鳳翼［16］在研究金槍魚罐頭中鳥糞石結晶時，指出當pH 值為5.9 到6.1 或更低時，不易看到磷酸銨鎂結晶生成。這也與我們得到的結論一致。

圖3 pH 值對氨氮和磷去除率的影響Fig.3 Effect of pH on removal rate of NH4+ and P

前期研究表明，青方腐乳后酵6 個月，pH 值上升到6.0 以上并隨著后酵時間的延長持續(xù)升高，說明青方腐乳中磷酸銨鎂結晶的產生可能與pH 值升高有關。

2.2.2 氨氮濃度對磷酸銨鎂結晶反應的影響

設定溶液中P 的濃度為0.082 24 mol/L，Mg∶P=1∶1(摩爾比)，N∶P 的摩爾比為1∶1、4∶1、8∶1、16∶1，模擬磷酸銨鎂結晶反應，測定磷的去除率結果如圖4所示。

圖4 氨氮濃度對磷去除率的影響Fig.4 Effect of NH4+ on removal rate of P

從圖4 中可以看出隨著N∶P 摩爾比的增大，磷的去除率從25%上升到75%，大幅增加，證明氨氮濃度對磷酸銨鎂結晶反應影響很大。

氨氮濃度對磷酸銨鎂結晶反應的影響相關文獻報道較多，王建森等［17］指出氨氮濃度增大能夠有效控制反應程度和反應速度。對于NH4+濃度對磷酸銨鎂結晶反應所致的影響，目前還不清楚其作用機理。

青方腐乳發(fā)酵較為徹底，腐乳鹵湯中氨氮濃度很高，有利于反應獲得較多的磷酸銨鎂結晶，這可能是青方腐乳結晶物增多的主要原因。

2.2.3 鹽含量對磷酸銨鎂結晶反應的影響

根據(jù)不同后酵時間腐乳樣品中食鹽含量的變化(圖5)，設定鹽含量分別為8 g/100 mL、10 g/100 mL、12 g/100 mL、14 g/100 mL、16 g/100 mL 進行模擬實驗。

圖5 鹽含量對氨氮和磷去除率的影響Fig.5 Effect of salt content on removal rate of NH 4+ and P

由圖5 可以看出，鹽含量對磷酸銨鎂結晶反應有一定影響，在實驗鹽含量范圍內，隨著鹽含量的升高磷和氨氮的去除率均減小，減少幅度不是很大，鹽含量增加1 倍，氨氮和磷的去除率約降低8%。NaCl含量增加主要改變溶液中離子強度，姚濤、王建森也都通過各自的研究證明溶液離子強度對磷酸銨鎂結晶有影響［17－18］。此外Kabdasli 等人［19］實驗研究了溶液中Na+、Cl－、SO2－4 等對磷酸銨鎂結晶反應的影響，發(fā)現(xiàn)Na+濃度高于50 mmo1/L 時，磷酸銨鎂結晶反應受到明顯的抑制。

2.2.4 酒精含量對磷酸銨鎂結晶反應的影響

在青方腐乳生產中，會把酒精含量作為一個主要的控制參數(shù)，加酒可以抑制微生物的生長，同時能使腐乳具有特殊的香味，加酒量一般控制在鹵湯的12%左右，因此選取酒精含量0、5°、10°、15°，進行磷酸銨鎂結晶反應的模擬實驗。

圖6 表明，在實驗酒精含量范圍內，隨著酒精含量升高氨氮和磷去除率有增大趨勢，但氨氮和磷去除率變化幅度不大，氨氮去除率由37%增大到41%，磷去除率由47.5%增大到52%，說明酒精含量對磷酸銨鎂結晶反應雖有影響但其影響程度較小。

實際生產中白方腐乳酒精含量遠大于青方腐乳酒精含量，只考慮酒精含量因素，白方腐乳結晶物現(xiàn)象理論上應該要比青方更嚴重，但是實際情況卻是白方腐乳幾乎不出現(xiàn)結晶物現(xiàn)象，可能與白方腐乳的發(fā)酵時間短有關。

圖6 乙醇含量對氨氮和磷去除率的影響Fig.6 Effect of alcohol content on removal rate of NH4+ and P

3 結論

(1)分析對比了不同后酵時間腐乳樣品的相關成分差異，證明了隨著后酵時間的延長青方腐乳發(fā)酵程度高，其鹵湯中氨氮濃度及pH 值顯著升高，磷含量先增加后減少，鎂含量持續(xù)降低;腐乳坯體中總酸含量、食鹽含量持續(xù)下降，氨氮含量初期增加隨后減少。初步推測結晶物的形成與否主要與腐乳樣品中氨氮和總酸含量有關，腐乳發(fā)酵徹底與否(發(fā)酵程度)可能是影響結晶物產生的決定性因素。

(2)探究了pH 值、氨氮濃度、酒度、鹽度等因素對磷酸銨鎂結晶反應的影響。實驗結果表明，pH 對于磷酸銨鎂生成有非常強的依存性，pH≤6.0 時氨氮和磷的去除率降到較低值，同時無結晶物生成，通過調節(jié)pH 值可以控制磷酸銨鎂結晶的產生;氨氮濃度對磷酸銨鎂結晶反應的影響程度很大，發(fā)酵徹底氨氮濃度增大可能是青方腐乳結晶物產生量大的主要原因;鹽度和酒度對磷酸銨鎂結晶反應影響效果不顯著，低鹽度高酒度有利于磷酸銨鎂結晶的生成。

［1］ 李幼筠. 中國腐乳的現(xiàn)代研究［J］. 中國釀造，2006(1):4 －7.

［2］ 魯緋. 腐乳發(fā)酵機理、品質改進和模式識別研究［D］.北京:中國農業(yè)大學，2005:23 －25.

［3］ 林影，盧榮德. 腐乳產品的氨基酸分析與白點研究［J］． 中國調味品，1999(9):13 －14.

［4］ 鮑松林，丁霄霖. 腐乳白點成分鑒定［J］. 無錫輕工業(yè)學院學報，1993，12(4):270 －275.

［5］ 汪景泉，毛霉馴化及微波對腐乳白點抑制效果的研究［D］. 重慶:西南大學，2009:17 －20.

［6］ 袁振遠，凌希利，張水華. 腐乳汁液中的結晶物［J］. 調味副食品科技，1982(01). 3 －6.

［7］ 黃永濤，盧紅梅. 腐乳中結晶物的研究［J］. 中國釀造，2012，31(2):59 －62.

［8］ 馬勇. 青方腐乳釀造技術研究［J］. 中國調味品，1996，(4):21 －23.

［9］ 王福榮. 生物工程分析與檢測［M］. 北京:中國輕工業(yè)出版社，2005:89 －93.

［10］ SB/T10170 －2007. 腐乳［S］.

［11］ 鄒安華，孫體昌，邢奕，等. pH 對MAP 沉淀法去除廢水中氨氮的影響［J］. 環(huán)境科學動態(tài)，2005 (4):4 －6.

［12］ 袁鵬，宋永會，袁芳，等. 磷酸銨鎂結晶法去除和回收養(yǎng)豬廢水中營養(yǎng)元素的實驗研究［J］．環(huán)境科學學報，2007，27(7):1127 －1134.

［13］ 王瑞芝. 中國腐乳釀造［M］. 北京:中國輕工業(yè)出版社，1998:135 －140.

［14］ Wild D，Kisliakova A，Siegrist H.P － fixation by Mg，Ca and zeolite A during stabilization of excess sludge from enhanced biological P － removal［J］.Water Science and Technology，1996，34:391 －398.

［15］ 付春. 青方腐乳湯料的配制技術中國釀造［J］.2005(3):39 －41.

［16］ 王鳳翼. 縮合磷酸鹽對罐頭食品質量的影響［J］. 食品工業(yè)科技，1983(5):47 －54.

［17］ 王建森，宋永會，袁鵬，等. 基于PHREEQC 程序的磷酸銨鎂結晶法污水處理工藝模型化研究［J］. 環(huán)境科學學報，2006，26(02):208 －213.

［18］ 姚濤，蔡偉民，李龍海. 磷酸胺鎂法處理含氮磷廢水的研究進展［J］. 中國給水排水，2005，21 (2):31 － 33.

［19］ Kabdasli I，Parsons S A，Tünay O. Effect of major ions on struvite crystallization［A］. International Conference for struvite:Its Role in Phosphorus Recovery and Recuse［C］．Cranfield university，UK. 2004.